Acupuntura en un modelo de rata de asma

Resumen

Una plataforma alta puede fijar ratas sin restricciones y exponer completamente los acupoints en la parte posterior durante la manipulación de la acupuntura. Este artículo describe los métodos para la fabricación de la plataforma alta, establece un modelo de rata de asma y mide los cambios en la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP) no invasivo y en tiempo real.

Resumen

Una plataforma alta puede fijar ratas sin restricciones y exponer completamente los acupoints en la parte posterior durante la manipulación de la acupuntura. Este artículo describe los métodos para la fabricación de la plataforma alta, establece un modelo de rata de asma y mide los cambios en la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP) no invasivo y en tiempo real.

Introducción

El asma es una enfermedad crónica caracterizada por broncoconstricción e hiper-capacidad de respuesta de las vías respiratorias^1. Aproximadamente 339,4 millones de personas en todo el mundo son diagnosticadas con asma^2. La prevalencia del asma está aumentando a nivel mundial, y se esperan 100 millones de nuevos casos en la próxima década^3. Los corticosteroides inhalados y los β de acción prolongada₂-agonistas no controlan eficazmente los síntomas de todos los pacientes⁴. Por lo tanto, el uso de terapias alternativas como la acupuntura para tratar el asma ha estado recibiendo mayor atención^5. Un método eficaz para tratar el asma es aguja GV14 (Dazhui), bilateral BL12 (Fengmen) y bilateral BL13 (Feishu)⁶. La acupuntura reduce significativamente los niveles de inmunoglobulina secretora A (SIgA) en la saliva y secreciones nasales de pacientes con asma alérgica y reduce los recuentos de eosinofílicos de sangre periférica con una tasa efectiva total de 85%^6. La acupuntura en BL13 y ST36 (Zusanli) en ratones con asma crónica disminuye el nivel de IL-17 en un 40% y disminuye el grosor muscular liso en un 33% en comparación con el del grupo ovalbumin (OVA), y aliviando así los síntomas de inflamación^7,8. Sin embargo, el mecanismo de tratamiento de acupuntura para el asma no está completamente claro.

Los modelos animales son una herramienta importante para la investigación del asma⁹ porque el modelo animal se puede utilizar para la medición continua de la función respiratoria para evaluar la eficacia del tratamiento para el asma^10. Mientras tanto, los estudios de la fisiopatología del asma requieren muestras de prueba, incluyendo muestras de la tráquea, pulmón y lavado broncoalveolar para verificar los cambios en los niveles de factores clave^11. Los modelos de rata de asma se utilizan comúnmente para evaluar la fisiopatología del asma porque producen respuestas duraderas en las vías respiratorias y muestran respuestas inmediatas y en fase tardía de las vías respiratorias^12. Sin embargo, debido a la estimulación experimental repetida, las ratas a menudo se vuelven irritables. Por lo tanto, se necesita un método adecuado para arreglar ratas. Los métodos comúnmente utilizados para la fijación de ratas incluyen anestesia y encuadernación^13. Aunque el método de anestesia proporciona una mejor exposición de los acupoints, puede afectar la conducción nerviosa y, en última instancia, afectar los resultados experimentales¹⁴. El método de unión no induce los mismos efectos fisiológicos que la anestesia, pero las ratas restringidas experimentarán tensión muscular esquelética. Además, la aguja no puede alcanzar fácilmente la posición designada^15. Aquí, presentamos una plataforma alta que se puede utilizar para fijar ratas sin restringirlas y exponer completamente los acupoints en la parte posterior. Las ratas se pueden colocar en la plataforma alta durante la administración de la acupuntura. La plataforma alta es capaz de acomodar a la rata sólo mientras está de pie, y como se coloca a cierta distancia del suelo, las ratas no se moverán debido al miedo a las alturas^16.

Este artículo describe en detalle la fabricación de la plataforma alta, el establecimiento de un modelo de rata de asma, el funcionamiento de la necesidad de una rata en la plataforma alta y la medición de la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP).

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de experimentos con animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (número de autorización ética PZSHUTCM190308020).

1. Fabricación de la plataforma alta

1. Ajuste la longitud y anchura del dispositivo de soporte a 86 cm x 17 cm (Figura 1).
2. Corrija el dispositivo de conexión verticalmente al dispositivo compatible. El dispositivo de conexión debe tener aproximadamente 30 cm de largo para evitar que la rata se ejecute a la superficie superior de la plataforma alta y tener una anchura de 14 cm.
3. Fije el pedal horizontal (5 cm x 5 cm) al dispositivo de conexión. La altura suspendida en la parte inferior del pedal horizontal debe ser mayor o igual que 50 cm.
   NOTA: Dependiendo del número de ratas experimentales, se pueden utilizar múltiples pedales horizontales, con una rata colocada en cada pedal.

2. Establecimiento de un modelo de rata de asma

1. Sensibilizar a las ratas con OVA
   1. Prepare la solución de sensibilización el día 0. Preparar cada 1 ml de la solución de sensibilización con 1 mg de OVA y 10 mg de hidróxido de aluminio, con solución salina normal como disolvente.
   2. Inyecte intraperitoneally cada rata con 1 ml de la solución de sensibilización el día 0. Dibuje la solución sensibilizante con una jeringa adecuada para su uso posterior.
   3. Coge la cola y levanta la rata, colóquela sobre una superficie áspera y tire suavemente de la cola hacia atrás. Sujete la piel de las orejas y el cuello con el pulgar izquierdo y el dedo índice mientras sujeta firmemente la piel posterior con los tres dedos y palmas restantes (tenga cuidado de abstenerse de aplicar el exceso de fuerza que asfixiará a la rata).
   4. Con la mano derecha, realice una inyección intraperitoneal en la rata con la jeringa preparada con 1 ml de solución de sensibilización.
2. Desafiando a las ratas con OVA
   1. Seleccione una caja con una tapa (la longitud, la anchura y la altura son de 39 cm x 28 cm x 23 cm) y perfore un pequeño agujero en el lateral. Conecte la caja sellada, la taza nebulizante y el nebulizador de compresión con un tubo de goma(Figura suplementaria 1).
      NOTA: El tamaño de partícula nebulizada del nebulizador comprimido es de 1 a 5 μm, la tasa de nebulización es mayor que 0,2 ml/min, y la presión final es de 205 kPa.
   2. El día 14 después de la sensibilización, abra la tapa de la caja sellada casera y coloque la rata en la caja (la caja puede acomodar 5 ratas), y luego coloque la caja sellada en un armario de bioseguridad.
   3. Prepare la solución de desafío. Mezclar a fondo 300 mg de OVA con 30 ml de solución salina normal.
   4. Encienda el nebulizador ultrasónico y agregue 30 ml de la solución de desafío en la taza nebulizadora. Ajuste la dosis de solución de desafío y el número de ratas según el volumen de la caja sellada casera.
   5. Repita la nebulización varias veces (una vez al día) o ajuste el procedimiento de acuerdo con la gravedad de los síntomas del asma.

3. Tratamiento de acupuntura

1. Seleccione acupoints, incluyendo GV14, BL12 bilateral y bilateral BL13, según la teoría de la medicina tradicional china para el tratamiento del asma(Figura Suplementaria 2). Administrar acupuntura manual el día 2 y realizar una vez cada dos días durante un total de 7 sesiones (Figura 2).
   1. Acupuntura el GV14 situado entre la séptima vértebra cervical y la primera vértebra torácica (el hueco de la escápula), en la línea media de la espalda(Figura 3).
   2. Acupuntura el BL13 situado debajo de la tercera vértebra torácica, a ambos lados de los espacios intercostales (borde inferior de la escápula).
   3. Acupuntura el BL12 situado debajo de la segunda vértebra torácica, a ambos lados de los espacios intercostales (por debajo de la escápula, posición identificada según BL13).
2. Agarra a las ratas y colócalos en la plataforma alta.
3. Sujete la aguja de acero inoxidable desechable (0,3 mm x 13,0 mm, figura suplementaria 3)con el pulgar y el dedo índice de la mano derecha, y presione la parte posterior de la rata con la palma de la mano derecha.
   NOTA: Las agujas desechables deben ser de un solo uso. Debido a que el uso repetido embotó la aguja, lo que conduce a un aumento del dolor en las ratas.
4. Toque la depresión en el centro del borde superior (GV14) o el borde inferior de la escápula (BL12 y BL13), y luego pinche suavemente la piel de la rata con la punta de la aguja para localizar los acupoints.
5. Inserte rápidamente la aguja después de determinar la ubicación específica del acupoint y retire rápidamente la mano derecha.
6. Torció uniformemente las agujas aproximadamente 360° a una velocidad de 60 veces/min durante 10 - 20 s, manipulándolas cada 5 minutos, y luego retirarlas después de 20 - 30 min(Figura Suplementaria 4).

4. La medición de Penh

1. Preparar metacolina: Coloque 100 mg de metacolina en un tubo centrífuga de 5 ml y agregue PBS a un volumen de 2 ml (metacolina de 50 mg/ml). A continuación, diluya la solución de metacolina de 50 mg/ml a 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml y 3.125 mg/ml.
2. Inspección de instrumentos
   1. Encienda el amplificador de señal (el sistema de distribución de aerosoles y el sistema de suministro de flujo de polarización de roedores están apagados y el conector de nebulización está cerrado).
   2. Compruebe los canales: Haga clic en Calibrar,devuelva la línea base de ajuste grueso a 0 y cambie a la posición de corriente directa (CC). Ajuste la línea de base a 0 e inyecte 5 ml de gas con una jeringa. A continuación, cambie a la posición alterna de corriente (CA).
   3. Después de comprobar los canales, asegúrese de que el valor de error sea inferior al 0,5%.
3. Parámetros de ajuste
   1. Encienda el sistema de distribución de aerosoles y el sistema de suministro de flujo de sesgo de roedores. Ajuste el caudal a 4,5 ml según el nivel de líquido de la bola de mercurio.
   2. Haga clic en Crear opciones de estudio y seleccione Estudio de respuesta a dosis,seleccione Rata de especies y haga clic en Siguiente.
   3. Seleccionar Lista de dosis simples, establezca el Número de dosis en 6 y haga clic en Siguiente.
   4. Seleccione los parámetros Penh y Area: Ajuste el tiempo de adaptación animal a 5 min, el tiempo de nebulización a 2 min, el tiempo de respuesta a 3 min y el tiempo de recuperación a 2 min.
   5. Añadir secuencialmente las siguientes soluciones al nebulizador (200 μL por rata): metacolina (0 mg/ml, 3.125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml y 50 mg/ml). Se pueden observar cambios en tiempo real en Penh (Figura 4).
   6. Después de que se hayan reaccionado las 6 soluciones con diferentes concentraciones, haga clic en Archivo y Finalizar sesión para completar el experimento.

Resultados

Con acupuntura en el GV14, BL12 bilateral y puntos bilaterales BL13, la rata mantiene una posición propensa. La rata puede girar su cabeza sólo hacia el exterior y no hacia el interior porque una dirección está bloqueada con una tabla de madera(Figura 5).

A medida que la concentración de metacolina aumentó, Penh muestra una tendencia creciente y la tasa de crecimiento aumenta gradualmente. A concentraciones de 3.125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml y ...

Discusión

Los acupoints GV14, bilaterales BL12 y bilaterales BL13 utilizados en este estudio se encuentran en la parte posterior, y por lo tanto la plataforma alta es adecuada para fijar ratas. En otros estudios, se debe seleccionar un método de fijación adecuado según la posición de los puntos^15. Para los acupoints en el abdomen, la rata se puede colocar hacia abajo en un cono negro (similar a una bolsa de pastelería utilizada por los panaderos)¹⁷. Una cadena se une al cono de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco