Agopuntura in un modello di ratto di asma

Riepilogo

Una piattaforma alta può riparare i ratti senza restrizioni ed esporre completamente gli acupoint sul retro durante la manipolazione dell'agopuntura. Questo articolo descrive i metodi per la fabbricazione dell'alta piattaforma, stabilisce un modello di ratto di asma e misura i cambiamenti nella funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale.

Abstract

Una piattaforma alta può riparare i ratti senza restrizioni ed esporre completamente gli acupoint sul retro durante la manipolazione dell'agopuntura. Questo articolo descrive i metodi per la fabbricazione dell'alta piattaforma, stabilisce un modello di ratto di asma e misura i cambiamenti nella funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale.

Introduzione

L'asma è una malattia cronica caratterizzata da broncocostrizione e iper-reattività delle vie aeree¹. A circa 339,4 milioni di persone in tutto il mondo viene diagnosticata l'asma². La prevalenza dell'asma è in aumento a livello globale, con 100 milioni di nuovi casi previsti per il prossimo^{decennio 3}. Corticosteroidi inalati e a β₂-agonisti non controllano efficacemente i sintomi di tutti i pazienti⁴. Pertanto, l'uso di terapie alternative come l'agopuntura per trattare l'asma ha ricevuto una maggiore^{attenzione 5}. Un metodo efficace per il trattamento dell'asma è l'ago GV14 (Dazhui), il BL12 bilaterale (Fengmen) e il bilaterale BL13 (Feishu)⁶. L'agopuntura riduce significativamente i livelli di immunoglobulina secretoria A (SIgA) nella saliva e nelle secrezioni nasali dei pazienti con asma allergica e riduce il numero di eosinofili del sangue periferico con un tasso effettivo totale dell'85%⁶. L'agopuntura a BL13 e ST36 (Zusanli) nei topi con asma cronica diminuisce il livello di IL-17 del 40% e diminuisce lo spessore muscolare liscio del 33% rispetto a quello del gruppo ovalbumina (OVA), alleviando così i sintomi infiammatori^7,8. Tuttavia, il meccanismo del trattamento dell'agopuntura per l'asma non è completamente chiaro.

I modelli animali sono uno strumento importante per la ricerca^{sull'asma 9} perché il modello animale può essere utilizzato per la misurazione continua della funzione respiratoria per valutare l'efficacia del trattamento dell'asma¹⁰. Nel frattempo, gli studi sulla fisiopatologia dell'asma richiedono campioni di prova, inclusi campioni di trachea, polmone e broncoalveolare per verificare i cambiamenti nei livelli dei fattori^{chiave 11}. I modelli di ratto dell'asma sono comunemente usati per valutare la fisiopatologia dell'asma perché producono risposte alle vie aeree di lunga durata e mostrano risposte immediate e tardive alle vie^{aeree 12}. Tuttavia, a causa della ripetuta stimolazione sperimentale, i ratti spesso diventano irritabili. Pertanto, è necessario un metodo adatto per riparare i ratti. I metodi comunemente utilizzati per la fissazione del ratto includono anestesia e legame¹³. Sebbene il metodo di anestesia fornisca una migliore esposizione degli acupoint, può influenzare la conduzione nervosa e, in ultima analisi, influenzare i risultati sperimentali¹⁴. Il metodo di legame non induce gli stessi effetti fisiologici dell'anestesia, ma i ratti trattenuti sperimenteranno la tensione muscolare scheletrica. Inoltre, l'ago non può raggiungere facilmente la posizione^{designata 15}. Qui, introduciamo un'alta piattaforma che può essere utilizzata per riparare i ratti senza limitarli ed esporre completamente gli acupoint sul retro. I ratti possono essere posizionati sulla piattaforma alta durante la somministrazione dell'agopuntura. La piattaforma alta è in grado di ospitare il topo solo mentre è in piedi, e poiché è posizionata a una certa distanza da terra, i ratti non si muoveranno a causa della paura delle altezze¹⁶.

Questo articolo descrive in dettaglio la fabbricazione dell'alta piattaforma, l'istituzione di un modello di ratto di asma, il funzionamento dell'accostamento di un topo sulla piattaforma alta e la misurazione della funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP).

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai (numero di autorizzazione etica PZSHUTCM190308020).

1. Fabbricazione dell'alta piattaforma

1. Impostare la lunghezza e la larghezza del dispositivo di supporto su 86 cm x 17 cm (Figura 1).
2. Fissare il dispositivo di connessione verticalmente al dispositivo di supporto. Il dispositivo di collegamento deve essere lungo circa 30 cm per impedire al topo di correre sulla superficie superiore della piattaforma alta e avere una larghezza di 14 cm.
3. Fissare il pedale orizzontale (5 cm x 5 cm) al dispositivo di collegamento. L'altezza sospesa nella parte inferiore del pedale orizzontale deve essere maggiore o uguale a 50 cm.
   NOTA: A seconda del numero di ratti sperimentali, è possibile utilizzare più pedali orizzontali, con un topo posizionato su ogni pedale.

2. Istituzione di un modello di ratto di asma

1. Sensibilizzare i ratti con oav
   1. Preparare la soluzione di sensibilizzazione il giorno 0. Preparare ogni 1 mL della soluzione di sensibilizzazione con 1 mg di OAV e 10 mg di idrossido di alluminio, con soluzione salina normale come solvente.
   2. Iniettare per via intraperitoneale ogni ratto con 1 mL della soluzione di sensibilizzazione il giorno 0. Disegnare la soluzione sensibilizzante con una siringa adatta per un uso successivo.
   3. Afferrare la coda e sollevare il topo, posizionarlo su una superficie ruvida e tirare delicatamente indietro la coda. Afferrare la pelle sia delle orecchie che del collo con il pollice sinistro e l'indice tenendo saldamente la pelle posteriore con le restanti tre dita e palmi (fare attenzione ad astenersi dall'applicare forza in eccesso che soffoca il topo).
   4. Con la mano destra, eseguire un'iniezione intraperitoneale nel ratto con la siringa preparata con 1 ml della soluzione di sensibilizzazione.
2. Ratti impegnativi con OAV
   1. Selezionare una scatola con un coperchio (la lunghezza, la larghezza e l'altezza sono 39 cm x 28 cm x 23 cm) e praticare un piccolo foro sul lato. Collegare la scatola sigillata, la tazza di nebulizzazione e il nebulizzatore di compressione con un tubo di gomma (Figura complementare 1).
      NOTA: La dimensione delle particelle nebulizzate del nebulizzatore compresso è di 1 - 5 μm, il tasso di nebulizzazione è maggiore di 0,2 mL/min e la pressione finale è di 205 kPa.
   2. Il 14 ° giorno dopo la sensibilizzazione, aprire il coperchio della scatola sigillata fatta in casa e posizionare il topo nella scatola (la scatola può ospitare 5 ratti), quindi mettere la scatola sigillata in un armadietto di biosicurezza.
   3. Preparare la soluzione di sfida. Mescolare accuratamente 300 mg di OAV con 30 mL di soluzione salina normale.
   4. Accendere il nebulizzatore ad ultrasuoni e aggiungere 30 mL della soluzione di sfida nella tazza di nebulizzazione. Regolare il dosaggio della soluzione di sfida e il numero di ratti in base al volume della scatola sigillata fatta in casa.
   5. Ripetere la nebulizzazione più volte (una volta al giorno) o regolare la procedura in base alla gravità dei sintomi dell'asma.

3. Trattamento dell'agopuntura

1. Selezionare gli acupoint, tra cui GV14, BL12 bilaterale e BL13 bilaterale, secondo la teoria della medicina tradizionale cinese per il trattamento dell'asma (Figura complementare 2). Somministrare l'agopuntura manuale il giorno 2 ed eseguire una volta ogni due giorni per un totale di 7 sessioni (Figura 2) .
   1. Agopuntura del GV14 situato tra la settima vertebra cervicale e la prima vertebra toracica (la cavità della scapola), sulla linea mediana della schiena (Figura 3).
   2. Agopuntura del BL13 situato sotto la terza vertebra toracica, su entrambi i lati degli spazi intercostali (bordo inferiore della scapola).
   3. Agopuntura il BL12 situato sotto la seconda vertebra toracica, su entrambi i lati degli spazi intercostali (sotto la scapola, posizione identificata secondo BL13).
2. Afferra i ratti e posizionali sulla piattaforma alta.
3. Tenere l'ago monouso in acciaio inossidabile (0,3 mm x 13,0 mm, figura complementare 3) maneggiare con il pollice e l'indice della mano destra e premere la parte posteriore del topo con il palmo della mano destra.
   NOTA: Gli aghi monouso devono essere monouso. Perché l'uso ripetuto attenuerà l'ago, il che porta ad un aumento del dolore nei ratti.
4. Toccare la depressione al centro del bordo superiore (GV14) o il bordo inferiore della scapola (BL12 e BL13), quindi pungere delicatamente la pelle del topo con la punta dell'ago per localizzare gli acupoint.
5. Inserire rapidamente l'ago dopo aver determinato la posizione specifica dell'acume e rimuovere rapidamente la mano destra.
6. Attorcigliato uniformemente gli aghi di circa 360° ad una velocità di 60 volte/min per 10 -20 s, manipolarli ogni 5 minuti, quindi ritirarli dopo 20-30 min(Figura complementare 4).

4. La misurazione penh

1. Preparare la metacolina: Mettere 100 mg di metacolina in un tubo di centrifuga da 5 ml e aggiungere PBS ad un volume di 2 ml (50 mg/mL di metacolina). Quindi, diluire la soluzione di metacolina da 50 mg/mL a 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL e 3,125 mg/mL.
2. Ispezione degli strumenti
   1. Accendere l'amplificatore di segnale (il sistema di distribuzione aerosol e il sistema di alimentazione del flusso di polarizzazione dei roditori sono tutti spenti e il connettore di nebulizzazione è chiuso).
   2. Controllare i canali: fare clic su Calibra, riportare la linea di base di regolazione grossolana a 0 e passare alla posizione corrente diretta (DC). Mettere a punto la linea di base su 0 e iniettare 5 ml di gas con una siringa. Quindi, passare alla posizione di corrente alternata (AC).
   3. Dopo aver controllato i canali, assicurarsi che il valore di errore sia inferiore allo 0,5%.
3. Impostazione dei parametri
   1. Accendere il sistema di distribuzione dell'aerosol e il sistema di alimentazione del flusso di polarizzazione dei roditori. Regolare la portata a 4,5 mL in base al livello del liquido sulla sfera di mercurio.
   2. Fate clic su Crea opzioni di studio (Create Study Options) e selezionate Studio risposta dose (Dose Response Study),selezionate Ratto di specie (Rat of species) e fate clic su Avanti (Next).
   3. Selezionare Elenco dose semplice, impostare il numero di dosi su 6 e fare clic su Avanti.
   4. Selezionare i parametri Penh e Area: impostare il tempo di adattamento dell'animale su 5 minuti, il tempo di nebulizzazione su 2 minuti, il tempo di risposta a 3 minuti e il tempo di recupero su 2 minuti.
   5. Aggiungere in sequenza le seguenti soluzioni al nebulizzatore (200 μL per ratto): metacolina (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL). Si possono osservare cambiamenti in tempo reale a Penh (Figura 4).
   6. Dopo aver reagito tutte e 6 le soluzioni con concentrazioni diverse, fare clic su File e sessione finale per completare l'esperimento.

Risultati

Con agopuntura ai punti GV14, BL12 bilaterali e BL13 bilaterali, il topo mantiene una posizione soggetta. Il topo può ruotare la testa solo verso l'esterno e non verso l'interno perché una direzione è bloccata con una tavola di legno(Figura 5).

Con l'aumento della concentrazione di metacolina, Penh mostra una tendenza all'aumento e il tasso di crescita aumenta gradualmente. A concentrazioni di 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL, Penh è au...

Discussione

Gli acupoint GV14, bilaterali BL12 e bilaterali BL13 utilizzati in questo studio si trovano sul retro, e quindi l'alta piattaforma è adatta per il fissaggio dei ratti. In altri studi, un metodo di fissazione adeguato deve essere selezionato in base alla posizione degli acupoint¹⁵. Per gli acupoint sull'addome, il topo può essere posizionato verso il basso in un cono nero (simile a un sacchetto di pasticceria utilizzato dai fornai)¹⁷. Una catena è attaccata al cono di rit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco