Acupuntura em um modelo de rato de asma

Resumo

Uma plataforma alta pode corrigir ratos sem restrições e expor completamente os pontos de acupoint na parte de trás durante a manipulação da acupuntura. Este artigo descreve métodos para a fabricação da alta plataforma, estabelece um modelo de asma de ratos e mede mudanças na função respiratória usando um sistema de plethysmografia não invasiva e em tempo real do corpo inteiro (WBP).

Resumo

Uma plataforma alta pode corrigir ratos sem restrições e expor completamente os pontos de acupoint na parte de trás durante a manipulação da acupuntura. Este artigo descreve métodos para a fabricação da alta plataforma, estabelece um modelo de asma de ratos e mede mudanças na função respiratória usando um sistema de plethysmografia não invasiva e em tempo real do corpo inteiro (WBP).

Introdução

A asma é uma doença crônica caracterizada pela broncoconstrição e hiper-responsividade das vias aéreas¹. Aproximadamente 339,4 milhões de pessoas em todo o mundo são diagnosticadas com asma². A prevalência de asma está aumentando globalmente, com 100 milhões de novos casos esperados para a próxima década³. Corticosteroides inalados e β₂-agonistas de longa duração não controlam efetivamente os sintomas de todos os pacientes⁴. Portanto, o uso de terapias alternativas como a acupuntura para tratar a asma vem recebendo maior atenção⁵. Um método eficaz para o tratamento da asma é agulha GV14 (Dazhui), BL12 bilateral (Fengmen) e bilateral BL13 (Feishu)⁶. A acupuntura reduz significativamente os níveis de imunoglobulina secreta A (SIgA) na saliva e secreções nasais de pacientes com asma alérgica e reduz a contagem de eosinófilos sanguíneos periféricos com uma taxa efetiva total de 85%⁶. A acupuntura em BL13 e ST36 (Zusanli) em camundongos com asma crônica diminui o nível de IL-17 em 40% e diminui a espessura muscular lisa em 33% em comparação com a do grupo ovalbumina (OVA) e, assim, alivia os sintomas de inflamação^7,8. No entanto, o mecanismo do tratamento da acupuntura para asma não é completamente claro.

Os modelos animais são uma importante ferramenta para a pesquisa da asma⁹ porque o modelo animal pode ser utilizado para a medição contínua da função respiratória para avaliar a eficácia do tratamento da asma¹⁰. Enquanto isso, estudos da fisiopatologia da asma requerem amostras de teste, incluindo amostras da traqueia, pulmão e lavagem broncoalveolar para verificar alterações nos níveis dos fatores-chave¹¹. Modelos de asma de ratos são comumente usados para avaliar a fisiopatologia da asma porque produzem respostas de longo prazo das vias aéreas e mostram respostas imediatas e tardias das vias aéreas¹². No entanto, devido à estimulação experimental repetida, os ratos muitas vezes se tornam irritáveis. Portanto, é necessário um método adequado para fixar ratos. Os métodos comumente utilizados para fixação de ratos incluem anestesia e vinculação¹³. Embora o método de anestesia proporcione melhor exposição dos acupoints, pode afetar a condução nervosa e, em última instância, afetar os resultados experimentais¹⁴. O método de ligação não induz os mesmos efeitos fisiológicos que a anestesia, mas ratos contidos experimentarão tensão muscular esquelética. Além disso, a agulha não pode alcançar facilmente a posição designada¹⁵. Aqui, introduzimos uma plataforma alta que pode ser usada para corrigir ratos sem restringi-los e expor totalmente os acupoints na parte de trás. Os ratos podem ser colocados na plataforma alta durante a administração da acupuntura. A plataforma alta é capaz de acomodar o rato apenas enquanto ele está de pé, e como ele é colocado a uma certa distância do chão, os ratos não se moverão por causa do medo das alturas¹⁶.

Este artigo descreve detalhadamente a fabricação da alta plataforma, o estabelecimento de um modelo de rato de asma, o funcionamento da necessidade de um rato na plataforma alta e a medição da função respiratória utilizando um sistema de plethysmografia do corpo inteiro (WBP).

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Protocolo

Todos os experimentos em animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (Número de liberação ética PZSHUTCM190308020).

1. Fabricação da alta plataforma

1. Defina o comprimento e a largura do dispositivo de suporte para 86 cm x 17 cm(Figura 1).
2. Corrija o dispositivo de conexão verticalmente ao dispositivo de suporte. O dispositivo de conexão deve ter aproximadamente 30 cm de comprimento para evitar que o rato escorra até a superfície superior da plataforma alta e tenha uma largura de 14 cm.
3. Fixar o pedal horizontal (5 cm x 5 cm) no dispositivo de conexão. A altura suspensa na parte inferior do pedal horizontal deve ser maior ou igual a 50 cm.
   NOTA: Dependendo do número de ratos experimentais, podem ser usados vários pedais horizontais, com um rato colocado em cada pedal.

2. Estabelecimento de um modelo de rato de asma

1. Sensibilizando os ratos com OVA
   1. Prepare a solução de sensibilização no dia 0. Prepare cada 1 mL da solução de sensibilização com 1 mg de OVA e 10 mg de hidróxido de alumínio, com soro fisiológico normal como solvente.
   2. Injete intraperitoneally cada rato com 1 mL da solução de sensibilização no dia 0. Desenhe a solução sensibilizadora com uma seringa adequada para uso posterior.
   3. Pegue a cauda e levante o rato, coloque-o em uma superfície áspera, e puxe suavemente a cauda para trás. Segure a pele das orelhas e pescoço com o polegar esquerdo e o dedo indicador, mantendo firmemente a pele traseira com os três dedos e palmas restantes (tenha cuidado para evitar aplicar força excessiva que sufocará o rato).
   4. Com a mão direita, realize uma injeção intraperitoneal no rato com a seringa preparada com 1 mL da solução de sensibilização.
2. Ratos desafiadores com OVA
   1. Selecione uma caixa com uma tampa (o comprimento, largura e altura são 39 cm x 28 cm x 23 cm) e faça um pequeno orifício na lateral. Conecte a caixa selada, o copo de nebulização e o nebulizador de compressão com um tubo de borracha(Figura Suplementar 1).
      NOTA: O tamanho da partícula nebulizada do nebulizador comprimido é de 1 a 5 μm, a taxa de nebulização é superior a 0,2 mL/min, e a pressão final é de 205 kPa.
   2. No 14º dia após a sensibilização, abra a tampa da caixa lacrada caseira e coloque o rato na caixa (a caixa pode acomodar 5 ratos), e depois coloque a caixa selada em um armário de biossegurança.
   3. Prepare a solução do desafio. Misture completamente 300 mg de OVA com 30 mL de soro fisiológico normal.
   4. Ligue o nebulizador ultrassônico e adicione 30 mL da solução de desafio na xícara de nebulização. Ajuste a dosagem da solução de desafio e o número de ratos de acordo com o volume da caixa lacrada caseira.
   5. Repita a nebulização várias vezes (uma vez por dia) ou ajuste o procedimento de acordo com a gravidade dos sintomas da asma.

3. Tratamento de acupuntura

1. Selecione pontos de acupoint, incluindo GV14, bilateral BL12 e bilateral BL13, de acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa para o tratamento da asma (Figura Suplementar 2). Administre acupuntura manual no dia 2 e realize uma vez a cada dois dias para um total de 7 sessões (Figura 2).
   1. Acupuntura o GV14 localizado entre a sétima vértebra cervical e a primeira vértebra torácica (a oca da escápula), na linha média da parte de trás(Figura 3).
   2. Acupuntura o BL13 localizado abaixo da terceira vértebra torácica, em ambos os lados dos espaços intercostais (borda inferior da escápula).
   3. Acupuntura do BL12 localizado abaixo da segunda vértebra torácica, em ambos os lados dos espaços intercostais (abaixo da escápula, posição identificada segundo BL13).
2. Segure os ratos e coloque-os na plataforma alta.
3. Segure a agulha de aço inoxidável descartável (0,3 mm x 13,0 mm, Figura Suplementar 3) com o polegar e o dedo indicador da mão direita, e pressione a parte de trás do rato com a palma da mão direita.
   NOTA: As agulhas descartáveis devem ser de uso único. Porque o uso repetido vai diminuir a agulha, o que leva ao aumento da dor em ratos.
4. Toque a depressão no meio da borda superior (GV14) ou na borda inferior da escápula (BL12 e BL13), e depois pique suavemente a pele do rato com a ponta da agulha para localizar os acupoints.
5. Insira rapidamente a agulha depois de determinar a localização específica do acupoint e remova rapidamente a mão direita.
6. Torcido uniformemente as agulhas aproximadamente 360° a uma taxa de 60 vezes/min para 10 - 20 s, manipulá-las a cada 5 minutos, e depois retirá-las após 20 - 30 min (Figura Suplementar 4).

4. A medição de Penh

1. Prepare a methacholina: Coloque 100 mg de metanfetamina em um tubo de centrífuga de 5 mL e adicione PBS a um volume de 2 mL (50 mg/mL de metanfetamina). Em seguida, diluir a solução de methacholina de 50 mg/mL para 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL e 3.125 mg/mL.
2. Inspeção de instrumentos
   1. Ligue o amplificador de sinal (o sistema de distribuição de aerossol e o sistema de alimentação de fluxo de viés de roedores estão todos desligados, e o conector de nebulização está fechado).
   2. Verifique os canais: Clique em Calibrar,devolva a linha de base de ajuste grosseiro para 0 e mude para a posição de corrente direta (DC). Ajuste a linha de base para 0 e injete 5 mL de gás com uma seringa. Em seguida, mude para a posição de corrente alternada (AC).
   3. Após a verificação dos canais, certifique-se de que o valor do erro seja inferior a 0,5%.
3. Definindo parâmetros
   1. Ligue o sistema de distribuição de aerossol e o sistema de alimentação de fluxo de viés de roedores. Ajuste a vazão para 4,5 mL de acordo com o nível líquido na bola de mercúrio.
   2. Clique em Criar opções de estudo e selecione Estudo de Resposta a Doses,selecione Rato de espécies e clique em Next.
   3. Selecione Lista de Doses Simples,defina o número de doses para 6 e clique em Next.
   4. Selecione os parâmetros penh e área: Definir o tempo de adaptação animal para 5 min, o tempo de nebulização para 2 min, o tempo de resposta para 3 min, e o tempo de recuperação para 2 min.
   5. Adicione sequencialmente as seguintes soluções ao nebulizador (200 μL por rato): metanfetamina (0 mg/mL, 3.125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL). Podem ser observadas alterações em tempo real em Penh(Figura 4).
   6. Depois de todas as 6 soluções com diferentes concentrações terem sido reagidas, clique em Arquivo e Sessão Final para concluir o experimento.

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Resultados

Com acupuntura no GV14, bl12 bilateral e pontos bl13 bilaterais, o rato mantém uma posição propensa. O rato pode torcer a cabeça apenas para o lado de fora e não para dentro porque uma direção está bloqueada com uma tábua de madeira(Figura 5).

À medida que a concentração de metanfetamina aumenta, Penh mostra uma tendência crescente e a taxa de crescimento aumenta gradualmente. Nas concentrações de 3.125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 m...

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Discussão

Os acupontos GV14, bilateral BL12 e bilateral BL13 utilizados neste estudo estão localizados na parte de trás, e, portanto, a plataforma alta é adequada para fixação de ratos. Em outros estudos, deve ser selecionado um método de fixação adequado de acordo com a posição dos acupoints¹⁵. Para acupoints no abdômen, o rato pode ser colocado para baixo em um cone preto (semelhante a um saco de massa usado pelos padeiros)¹⁷. Uma corrente é presa ao cone de contenção...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco