在行为和刺激反应期间为整个大脑成像准备成人德罗索菲拉褪黑麦片加斯特

摘要

我们提出了一种专门针对成人 德罗索菲拉 在行为和刺激过程中的整个大脑进行成像的方法。头部被定位为允许光学访问整个大脑，而苍蝇可以移动其腿和天线，前体尖端，眼睛可以接收感官刺激。

摘要

我们介绍了一种专门为在行走等持续行为中对整个 德罗索菲拉 大脑进行成像的方法。优化头部固定和解剖，以尽量减少它们对行为的影响。这是首先通过使用将运动障碍降至最低的支架实现的。苍蝇的后脑勺粘在这个支架上的角度，允许光学访问整个大脑，同时保持苍蝇的行走，新郎，嗅觉，味道和看到的能力。对后脑勺进行解剖，以去除光学路径中的组织和负责头部运动人工制品的肌肉。飞脑随后可以被成像来记录大脑活动，例如使用钙或电压指示器，在特定的行为，如行走或梳妆，并响应不同的刺激。一旦具有挑战性的解剖，这需要大量的实践，已经掌握，这项技术允许记录丰富的数据集有关整个大脑活动的行为和刺激反应。

引言

使用各种技术成像大脑活动加深了对大脑功能的理解。在人类中，大脑成像技术有重要的局限性:虽然功能性磁共振成像（fMRI）提供的时空分辨率远远低于单个神经元分辨率，但快速技术，如脑电图（EEG），只允许间接和部分进入大脑^1。在足够大的动物模型，如啮齿动物，记录荧光活动传感器（如，GCaMP）使用头戴显微镜允许观察大脑活动，而动物在其环境中移动^2。然而，这些技术目前只允许进入大脑的一小部分。头固定动物可以更全面地成像，但覆盖范围仍然是部分的（例如皮层表面^3）。只有在小动物，如斑马鱼幼虫，C.elegans和德罗索菲拉，整个大脑可以图像与时间和空间分辨率的水平或接近单一神经元^4。

D.梅拉诺加斯特是特别有希望的，因为它长期以来一直被用作遗传模型生物^体5和强大的遗传工具已经开发^6。辅之以由电子显微镜⁷衍生而成的新型大规模解剖网络，苍蝇可以为研究大型网络⁸产生的复杂大脑动力学提供独特的机会。虽然地层不透明，因此必须去除以成像大脑，但自2002年9月首次研究以来，体内功能成像已变得越来越^{普遍，并且}已经发布了一些协议。但是， 这些方法包括要么将苍蝇头与身体¹⁰分离，严重限制苍蝇的运动和/或对刺激11、12、13、14、15的反应，要么只允许一小部分 大脑的图像9，16，25，26，27，17，18，19，20，21，22，23，24。为了补充这些强大的方法，我们最近开发了一个准备图像整个大脑的行为和反应的各种刺激^28。

在这里，我们以这项研究为基础，提出一种专门为整个大脑成像而开发的方法，而苍蝇则执行半自然行为（即行走和梳妆），并响应感官刺激。这是通过使用一个观察支架实现的，该观察支架设计用于从后部进入整个大脑，同时保持天线和前臂完好无损，并允许苍蝇移动其腿部行走（例如，在气垫球上）。剖析后脑勺的步骤经过了改进，以加快速度、可重复性，并最大限度地减少它们对苍蝇生存能力和移动性的影响。

研究方案

所有步骤均在立体显微镜下执行。

1. 准备支架

1. 使用 3D 打印机打印持有人"FlyholderVJove.stl"（参见 补充材料），或使用在线服务打印 （图 1A）。SLS （尼龙 PA12） 和多喷射融合 （PA12） 都适合。
2. 创建头部插槽。
   1. 将一块胶带矩形地放在平坦的表面上。切一片约5毫米×1厘米。使用固定平行刀片（两个手术刀刀片粘在一起）在胶带较长侧的中间切开颈部槽（~400 x 400 μm），以确保每个支架的宽度相同（图 1B）。
   2. 将胶带放在底部支架上孔的平坦侧（参见 图 1C 和图 1D）。磁带可以通过在孔周围用钳子向下推约 500 μm 来变形;这将进一步最大限度地减少阻碍以后的飞行运动。
   3. 用黑色指甲油盖住胶带和顶部的支架，以防止缓冲区泄漏。黑色指甲油还将保护苍蝇的眼睛免受显微镜的刺激光。使用支架前至少一小时让指甲油干燥。
   4. 指甲油干燥后，使用滚动组织在头部槽中加入 ~1 μL 的润滑脂，以确保胶水不会弄湿苍蝇的后脑勺（图 2A）。确保不要将油脂放在槽外，以防止胶水粘附。
3. 创建机身插槽（图 2B）。
   1. 可选地，提前准备用于定位苍蝇身体的磁带（见下文）。使用 图 2B（顶部）中显示的设计，将一块约 2 厘米宽的胶带切成两片，并切成 1.5 毫米宽的切片。切出0.3毫米深的肩膀和身体槽。确保它适合支架。
      注意:苍蝇大小（特别是性别、年龄、基因型或物种）之间的变异性可以使得调整磁带设计变得必要。如果头部往往偏向不集中，则暂时在颈部槽上添加一块 V 形胶带（图 3）会很有帮助。还要在颈部槽槽内和 V 形胶带上涂抹几微升润滑脂。

2. 放置苍蝇

注:一到四天大的雌性苍蝇是理想的，因为雌性苍蝇的头更大，因此比雄性苍蝇更容易解剖，而年轻的苍蝇有更柔软的金质层。对于行走实验，通过将实验与较高的昼夜活动时间（ZT0或ZT11）相匹配，使用含葡萄糖的盐水（如103毫克、3m KCl、5m TES、8m三氯蔗糖2 H₂O） 来增加苍蝇的活性。 10 mM 葡萄糖， 26 mM NaHCO₃， 1 mM NaH₂PO_4，2.5 mM CaCl₂+2 H₂O， 4 mM MgCl₂+6 H₂O），通过饥饿的苍蝇高达24小时与水只的环境，并通过加热环境到+28°C在实验期间。提前至少一天剪翅膀也有助于减少飞行尝试，从而增加^{步行7、29、30}的频率。

1. 用冰填充培养皿或移液器尖盖，将实验室组织放在冰上，并将支架倒置在冰上。
2. 将一只苍蝇从小瓶中吸进管子里，吹到冰上（确保冰不会融化，从而淹没苍蝇），从而使其瘫痪。
3. 当苍蝇停止移动时，使用沉闷的钳子将其滑入支架，颈部在插槽内（苍蝇可以在机翼的基座上保持），如 图4（左图）。眼睛应该在插槽的两侧处于等位置（图4，中间）。如果需要，在头顶上添加 1 μL 润滑脂，以防止胶水（见下一步）到达后脑勺，并在以后去除。
4. 用纸巾和冰盖住身体，以确保苍蝇在下一步和下一步（图4，右图）中不会移动。防止腿部到达头部的另一种选择是使用头部正下方的一块胶带（见图6）。

3. 固定头部

1. 将头部从完全后视图（围绕横向轴，参见 图 5A）置于 ~20° 角度。这是减少图像深度和另一侧保持前腿自由移动和尽量减少颈部伸展之间的妥协。
2. 用卷起的组织（图5B），把紫外线胶水放在头部，同时避免弄脏感兴趣的感官区域（天线，前体和/或眼睛）。对于味觉实验，将前体拔出，并在其底部添加胶水以防止运动。如果没有口味实验计划，proboscis最好推入头部，用胶水固定，以尽量减少运动（图6）。
3. 用紫外线将胶水固化5s。用卷起的组织仔细清洁头部周围，去除可能粘在腿部和/或土壤感官区域的剩余液体胶水。
   注意:磁带可以用砂纸粗加工，如有必要，可增加胶粘附。
4. 使用薄薄的胶带或卷起的组织将腿移到前面（如果它们尚未），因此它们不会在下一步损坏。

4. 定位身体

注意:此步骤需要快速执行:在苍蝇从麻醉中恢复过来之前

1. 取出冰容器，将支架转动。用纸巾取出苍蝇周围的水。
2. 将身体槽带（在第 1 步中创建）放在孔上，轻轻地将苍蝇的身体向下推（图 7）。小心不要把脖子伸得太多。

5. 密封孔

1. 用胶带盖住剩余的大孔。
2. 在头部后部和颈部区域添加 ~1 μL 的润滑脂，以确保那里的胶水不会湿润。
3. 用卷起的组织，油漆紫外线胶水周围和磁带的顶部和胸腔（上端的躯干部分的同位素）来修复它。用紫外线将胶水固化约5s。
   注意:尽量减少紫外线的使用非常重要，因为它会强烈地影响苍蝇的健康。
4. 用实验室组织小心清洁油脂和未粘附的胶水。
5. 将~1 mL盐水放在头部顶部。用钳子将气泡推到一边。通过在盐碱上放置盖片并转动支架以检查前侧的盐水来查找泄漏。如果有任何泄漏，去除盐水并修复孔（要么添加更多的胶水或更多的油脂）。
   注意:如果有必要，现在可能是暂停的好时机。苍蝇可以提供一小块组织或发泡胶球走，以防止飞溅和平静的苍蝇下来。

6. 解剖头部

注意:使用锐化钳子进行以下步骤。非常细的钳子是至关重要的，因为沉闷的钳子将使它更难打开头部肌骨，并可能导致额外的伤害在飞行的头部或大脑。在这个阶段，强放大可以帮助。为了达到这个目的，人们可以用30倍的眼光代替双目显微镜的眼科。

1. 在颈部两侧的中央暗角三角形底部进行两次切割（见 图 8A中的十字架）。
2. 切开暗三角形，取出角质层的这一部分。
3. 大脑中肌肉16和食道通过的洞现在应该是可见的，并有节奏地移动（视频1 呈现这种有节奏的运动，在苍蝇与荧光肌肉）。小心捏这个区域的顶部，以削减肌肉16，而不会刺穿食道。如果大脑的有节奏的运动停止，肌肉16可能会被移除，但是，运动有时暂停，稍后重新启动。因此，重要的是要注意有节奏的动作，并在必要时再次执行这一步骤。
4. 将剩余的皮质层切成小块，并小心地取出。尽量不要拉过多的乳酸。相反，像一把剪刀一样使用钳子来切割组织碎片。人们可以从中间边缘开始，在中间边缘，黑三角形之前被移除，并工作的方式到两侧。
   注:如果存在，可使用片断的皮质层轻轻刮伤脂肪体。
5. 一个接一个地取出空气袋，用钳子抓住它们，缓慢而稳定地拉。

结果

上述制备允许在显微镜下观察整个大脑进行大规模3D成像，如经典2光子或共聚焦显微镜，但也允许更快的技术，如光片³¹和其他结构化照明显微镜技术（在³²中审查），或光场显微镜^28。

在观察行为和保持功能感官器官的同时进入整个大脑，可以回答几个问题。

首先，当苍蝇处于休息、行为和对刺激的反应时，大脑的整体活动是什么？例如，我们包括通过光场显微镜获得的数据，这些显微镜显示大脑在对刺激和行为的反应中激活。例如，在视频 2中，所有神经元（nsyb-GAL4 和 UAS-syt-GCaMP6s（左）或 UAS-GCaMP6M（右）都表示了钙探针，并呈现了一股气味。请注意，在应对刺激的过程中，准备如何能够全面了解大脑活动。Drosophila 中强大的遗传工具可用于将这些传感器的表达限制在特定的神经元亚型上。在视频3中，我们限制钙传感器的表达多巴明和血清素神经元（TH-GAL4，DDC-GAL4和UAS-GCaMP6M）。请注意，大脑中与飞行行走密切相关的强同步活动，允许在行为过程中观察整个大脑。除了钙活性外，还可以对其他物理或化学信号进行成像（例如，使用电压^28、33、代谢产品^34、35或特定神经调节器³⁶的传感器）。

为了更具体地理解大脑活动的作用，我们可以问哪些区域参与了什么行为、对刺激的反应或自发的活动模式。数据确实可以用作一个公正的屏幕，使用主要组件分析和独立组件分析等技术提取功能区域。 图 9A 以不同颜色显示不同的功能区域。功能区域的形状和本地化允许将它们映射到解剖模板上，以识别大脑区域，在某些情况下还允许识别神经元类型。此外，一旦与解剖模板对齐，在解剖大脑区域可以平均荧光值进行定量分析（见 图9B）。例如，应用于 图 9B 数据的分层高斯模型显示，区域在行走过程中更活跃（ΔF/F 中位数为 0.029， 95% 可信区间=[0.017 0.041]），但新郎期间不可信（ΔF/F 中位数 = -0.0049，95% 可信区间=-0.016 0.0059]）。

为了增加理解深度，准备允许的不同功能区域的同步记录可用于研究功能网络的动态特性。这一点很重要，因为到目前为止研究的所有大脑的大脑区域都是高度反复的相互关联的，越来越多的研究表明，即使是感官区域也会对动物的行为状态做出反应。可以查看几个方面，例如功能图形属性（例如模块）和可以与动态系统配合的时态模式（如示例^{见 8）。}

图1:准备支架（第1步）。A） 支架设计（从顶部查看）。 B） 颈部插槽准备。顶部:胶带设计，底部:用于切割颈部槽的平行刀片。 C） 从下面查看持有人。D） 底部视图指示在哪里添加颈部插槽胶带。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2:进一步准备（第1步）。A） 将油脂加入颈部槽中，以防止胶水覆盖后脑勺，防止盐水泄漏。比例杆，1毫米 B）顶部:用于向下推身体的胶带的形状。底部:确保磁带适合支架。 请单击此处查看此图的更大版本。

图3:放置一个V形胶带，以帮助中心。（A） 底部视图。（B） 顶部视图。缩放栏，2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:放置苍蝇（第2步）。左，使用两个沉闷的钳子放置身体，使颈部在颈部槽。中间，对齐头部。眼睛双侧位于插槽边缘。苍蝇的头是直的。对，用覆盖着冰的组织夹住苍蝇，防止它移动。缩放栏，1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:修复头部（第3步）。A） 头部的理想角度。 B） 在头部周围添加紫外线胶水，避免感官感兴趣的区域。缩放栏，1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:探针的尖端和天线可以保持没有胶水（第3步）。白圆表示应用紫外线胶的区域。箭头显示哪些部分没有胶水用于嗅觉和阵风实验。注意防止腿部接触胶水区域的可选胶带。比例栏， 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。

图7:放置背面胶带（第4.2步）。第 1 步（见 图 2，左）中创建的磁带用于放置主体并盖住支架上的大孔。缩放栏，1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图8:解剖步骤（第6步）。A-B）在暗三角形（十字架）底部切开每一侧，并移除角质层 C的这一部分。 D） 和 E） 去除肌肉 16.然后轻轻地去除其余的基质层 F），空气袋 G），和肌肉。 H） 解剖头部。比例栏， 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。

图9:代表性结果。A） 功能区域（使用 PCA 和 ICA 提取，如²⁸年）用于用光场显微镜（25 倍、NA=0.95 与匹配的 f/12 微镜头阵列）进行表达 GCaMP6 泛神经成像的苍蝇。比例杆，100μm.B）在刺激和行为反应期间大脑大区域的平均钙活性（从²⁸转载）。 请单击此处查看此图的更大版本。

视频1:肌肉16运动（第6.3步）。 GFP表现在肌肉上。注意气管上方孔的抽水运动。 请点击这里下载此视频。

视频2:泛神经钙活动在回应气味的两种不同的准备。香醋被吹到苍蝇上。泛神经钙活性（nsyb-GAL4 驱动程序、UAS-syt-GCaMP6s 左侧和 UAS-GCaMP6M 右侧）用光场显微镜（25 倍、NA=0.95 与匹配的 f/12 微透镜阵列进行成像）。光场图像随后被重建，如参考^28，37所述。请点击这里下载此视频。

视频3:行为过程中神经元类型子集中的钙活性。 GCaMP6以多巴明和血清素神经元（与TH-GAL4和DDC-GAL4）表示。结合苍蝇遗传工具，制备允许观察在行走期间许多区域的活动有很强的增加。 请点击这里下载此视频。

补充材料。请单击此处下载此文件。

讨论

嗜血杆菌 是罕见的成年动物之一，在复杂的行为中可以成像整个大脑。在这里，我们提出了一种方法，准备苍蝇，并暴露其整个大脑图像正在进行的整个大脑活动。应注意若干要点。

解剖像 德拉诺加斯特 这样的小动物是具有挑战性的。因此，这种方法需要大量的实践和耐心来掌握它。但是，培训后，该过程需要不到 30 分钟，并产生可重复的结果。

我们介绍的方法有额外的限制。首先，将苍蝇头从其自然位置倾斜会导致伸展颈部，从而可能损害结缔组织、神经或肌肉。第二，虽然心室食道区（SEZ）是光学可访问的，但它低于半透明食道，这降低了这一区域的强度和分辨率。最后，虽然持有人在大多数方向是遥不可及的，苍蝇有时仍然意识到它的存在，并推动它试图逃脱。

尽管有这些限制，但从整个大脑成像过程中获得的全面数据以及对刺激的反应将使动物与复杂自然环境相互作用和导航时，能够破译整个网络水平的大脑功能。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	FST by DUMONT	11252-30	straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long
#55 forceps	FST by DUMONT	11255-20	straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long
30x oculars	yegren	WF30-9-30-H	WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle
AHOME/UV flashlight	Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd	B07V2W9543 (ASIN)	365 nm
Fotoplast Gel/UV Glue	Dreve Otoplastik GmbH	44791	GHS07, GHS08
Gloss Finish Transparent Tape	3M Scotch
KIMTECH Science/Precision wipes	Kimberly-Clark Professional	7552	11 x 21 cm
KL 1500 LCD/Microscope light	Schott
Leica MS5 Microscope	Leica		WF30X/9
Nail Lacqueur	Opi Products Inc., N. Hollywood	6306585338	black
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose	Sigma Aldrich
Scalpel	Werner Dorsch GmbH	78 621; B07SXCXWFS (ASIN)	soft handle
Vacuum grease	Dow corning	0020080 /100 gr	Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g