Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

Resumo

Apresentamos um método especificamente adaptado para a imagem de todo o cérebro da Drosophila adulta durante o comportamento e em resposta a estímulos. A cabeça está posicionada para permitir acesso óptico a todo o cérebro, enquanto a mosca pode mover suas pernas e antenas, a ponta do proboscis, e os olhos podem receber estímulos sensoriais.

Resumo

Apresentamos um método desenvolvido especificamente para a imagem de todo o cérebro de Drosophila durante comportamentos contínuos, como a caminhada. A fixação e dissecção da cabeça são otimizadas para minimizar seu impacto no comportamento. Isso é conseguido pela primeira vez usando um suporte que minimiza os obstáculos de movimento. A parte de trás da cabeça da mosca é colada a este suporte em um ângulo que permite acesso óptico a todo o cérebro, mantendo a capacidade da mosca de andar, noivo, cheirar, saborear e ver. A parte de trás da cabeça é dissecada para remover tecidos no caminho óptico e músculos responsáveis pelos artefatos de movimento da cabeça. O cérebro de mosca pode ser posteriormente imageado para registrar a atividade cerebral, por exemplo, usando indicadores de cálcio ou tensão, durante comportamentos específicos, como caminhar ou aliciamento, e em resposta a diferentes estímulos. Uma vez que a dissecção desafiadora, que requer uma prática considerável, tenha sido dominada, essa técnica permite registrar conjuntos de dados ricos relacionando toda a atividade cerebral a respostas de comportamento e estímulo.

Introdução

A atividade cerebral por imagem usando várias técnicas aprofundou a compreensão da função cerebral. Em humanos, as técnicas de imagem cerebral têm limitações importantes: enquanto a ressonância magnética funcional (fMRI) oferece resolução espátula-temporal muito abaixo da resolução de neurônios únicos, técnicas rápidas como a eletroencefalografia (EEG) só permitem acesso indireto e parcial ao cérebro¹. Em modelos animais suficientemente grandes, como roedores, o registro de sensores de atividade fluorescente (por exemplo, GCaMP) usando microscópios montados na cabeça permite observar a atividade cerebral enquanto o animal está se movendo em seu ambiente². No entanto, essas técnicas atualmente dão acesso apenas a uma pequena parte do cérebro. Animais com fixação da cabeça podem ser imagens de forma mais abrangente, mas a cobertura ainda é parcial (por exemplo, a superfície do córtex³). É apenas em animais pequenos, como as larvas de zebrafish, C. elegans e Drosophila que todo o cérebro pode ser imageado com resolução temporal e espacial ao nível ou próximo de neurônios^{únicos 4}.

D. melanogaster é particularmente promissor porque tem sido usado há muito tempo como um organismo modelo genético⁵ e poderosas ferramentas genéticas foram^{desenvolvidas 6}. Complementada pela nova rede anatômica em larga escala derivada da microscopia eletrônica^7,a mosca poderia fornecer oportunidades únicas para estudar dinâmicas cerebrais complexas geradas em uma rede de grande escala⁸. Embora a cutícula não seja transparente e, portanto, deve ser removida para imagem do cérebro, a imagem funcional in vivo tornou-se cada vez mais comum desde o primeiro estudo em 2002⁹ e vários protocolos já foram publicados. No entanto, esses métodos envolvem separar a cabeça de mosca do corpo^10,restringindo severamente os movimentos e/ou respostas da mosca aos estímulos^{11,12,13,14,15}, ou apenas permitindo um pequeno parte do cérebro a ser imageado^{9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24}. Para complementar essas abordagens, no entanto, poderosas, desenvolvemos recentemente uma preparação para imagem de todo o cérebro durante o comportamento e respostas a vários estímulos²⁸.

Aqui, baseamos neste estudo para apresentar um método especificamente desenvolvido para imagem de todo o cérebro enquanto a mosca executa comportamentos seminat naturalistas (ou seja, caminhada e preparação) e responde a estímulos sensoriais. Isso é conseguido usando um suporte de observação projetado para dar acesso a todo o cérebro a partir do lado dorsal-posterior, deixando as antenas e proboscis intactas, e permitindo que a mosca mova suas pernas para andar (por exemplo, em uma bola amortecida a ar). Os passos para dissecar a parte de trás da cabeça foram refinados para velocidade, reprodutibilidade e para minimizar seu efeito sobre a viabilidade e mobilidade da mosca.

Protocolo

Todas as etapas são executadas sob um estereótipo.

1. Preparando o titular

1. Imprima o titular 'FlyholderVJove.stl' (ver Material Suplementar) com uma impressora 3D ou imprima-o usando serviços online(Figura 1A). Tanto SLS (Nylon PA12) quanto multijet fusion (PA12) são adequados.
2. Crie o slot da cabeça.
   1. Coloque um pedaço de fita adesiva retangularmente sobre uma superfície plana. Corte uma fatia de aproximadamente 5 mm x 1 cm. Corte a ranhura do pescoço (~400 x 400 μm) no meio do lado mais longo da fita usando lâminas paralelas fixas (duas lâminas de bisturi grudes grudes) para garantir a mesma largura em cada suporte(Figura 1B).
   2. Coloque a fita sobre o lado liso do orifício no suporte na parte inferior (ver Figura 1C e Figura 1D). A fita pode ser deformada empurrando-a para baixo com fórceps ~500 μm ao redor do buraco; isso minimizará ainda mais o impedimento dos movimentos posteriores de moscas.
   3. Cubra a fita e o suporte de cima com esmalte preto para evitar que o tampão vaze. O esmalte preto também protegerá os olhos da mosca da luz de excitação do microscópio. Deixe o esmalte secar pelo menos uma hora antes de usar o suporte.
   4. Uma vez que o esmalte esteja seco, adicione ~1 μL de graxa na ranhura da cabeça usando um tecido enrolado para garantir que a cola não molhe a parte de trás da cabeça da mosca(Figura 2A). Certifique-se de não colocar graxa fora da ranhura que evitaria que a cola grude.
3. Criar a ranhura do corpo(Figura 2B).
   1. Opcionalmente, prepare a fita que será usada para posicionar o corpo da mosca (veja abaixo) com antecedência. Use o design mostrado na Figura 2B (parte superior) para cortar um pedaço de fita de ~2 cm de largura em duas e cortar fatias de 1,5 mm de largura. Corte 0,3 mm de ombros profundos e ranhura corporal. Certifique-se de que ele se encaixa no suporte.
      NOTA: A variabilidade entre tamanhos de mosca (em particular com sexo, idade, genótipo ou espécie) pode tornar necessário ajustar o desenho da fita. Se a cabeça tende a ser mal centrada, pode ser útil adicionar uma fita em forma de V temporariamente sobre a ranhura do pescoço(Figura 3). Aplique também alguns microliters de graxa dentro da ranhura do pescoço e na fita em forma de V.

2. Colocar a mosca

NOTA: Moscas fêmeas de um a quatro dias de idade são ideais porque a cabeça feminina é maior e, portanto, mais fácil de dissecar do que a cabeça masculina, e moscas mais jovens têm cutícula mais macia. Para experimentos de caminhada, a atividade da mosca pode ser aumentada combinando os experimentos com tempos de maior atividade circadiana (ZT0 ou ZT11), usando soro fisiológico contendo glicose (como 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H₂O, 10 mM de glicose, 26 mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂·2 H₂O, 4 mM MgCl₂·6 H₂O), passando fome a mosca até 24 h com um ambiente somente de água, e aquecendo o ambiente a ~28 °C durante o experimento. Cortar as asas com pelo menos um dia de antecedência também ajuda a diminuir as tentativas de voar e, assim, aumentar a frequência de ataques de caminhada^7,29,30.

1. Encha uma placa de Petri ou a tampa da caixa de ponta de pipeta com gelo, coloque um tecido de laboratório em cima do gelo e coloque o suporte de cabeça para baixo sobre ele.
2. Transfira uma mosca no gelo para paralisá-la, sugando-a de seu frasco para um tubo e soprando-a para o gelo (certifique-se de que o gelo não seja derretido, o que afogaria a mosca).
3. Quando a mosca parar de se mover, use fórceps maçante para deslizá-lo para dentro do suporte com o pescoço dentro da fenda (a mosca pode ser mantida na base da asa) como na Figura 4 (esquerda). Os olhos devem estar em posições iguais em relação aos lados da ranhura(Figura 4, meio). Se necessário, adicione 1 μL de graxa na parte superior da cabeça para evitar que a cola (veja o próximo passo) atinja a parte de trás da cabeça e remova mais tarde.
4. Cubra o corpo com um tecido e um pouco de gelo para garantir que a mosca não se mova durante esta etapa e a próxima(Figura 4, à direita). Outra opção para evitar que as pernas cheguem à cabeça é usar um pedaço de fita logo abaixo da cabeça (ver Figura 6).

3. Fixar a cabeça

1. Coloque a cabeça em um ângulo ~20° a partir de uma visão totalmente posterior (ao redor do eixo lateral, ver Figura 5A). Este é um compromisso entre diminuir a profundidade para a imagem e do outro lado manter a perna dianteira livre para se mover e minimizar o estiramento do pescoço.
2. Com um tecido enrolado(Figura 5B),coloque cola UV ao redor da cabeça, evitando sujar a área sensorial de interesse (antenas, proboscis e/ou olhos). Para experimentos de sabor, puxe o proboscis para fora e adicione cola em sua base para evitar o movimento. Se nenhum experimento de sabor for planejado, o proboscis é melhor empurrado para a cabeça e fixado com cola para minimizar o movimento(Figura 6).
3. Cure a cola com luz UV para 5 s. Limpe cuidadosamente o circundante da cabeça com um tecido enrolado para remover a cola líquida restante que pode grudar nas pernas e/ou áreas sensoriais do solo.
   NOTA: A fita pode ser áspera com lixa para aumentar a adesão à cola, se necessário.
4. Use uma fina tira de fita ou um tecido enrolado para mover as pernas para a frente (se ainda não estiverem), para que não sejam danificadas pelo próximo passo.

4. Posicionamento do corpo

NOTA: Esta etapa precisa ser executada rapidamente; antes que a mosca se recupere da anestesia.

1. Retire o recipiente de gelo e gire o suporte. Remova a água ao redor da mosca com um tecido.
2. Coloque a fita do entalhe do corpo (criada no passo 1) sobre o orifício e empurre suavemente o corpo da mosca para baixo(Figura 7). Tenha cuidado para não esticar muito o pescoço.

5. Selar o buraco

1. Cubra os buracos grandes restantes com fita adesiva.
2. Adicione ~1 μL de graxa na parte de trás da cabeça e na área do pescoço para garantir que nenhuma cola molhe lá.
3. Com um tecido enrolado, pinte cola UV ao redor e em cima da fita e no tórax (parte dorsal superior do mesonotum) para corrigi-lo. Cure a cola com luz UV por ~5 s.
   NOTA: É importante minimizar o uso da luz UV, pois pode afetar fortemente a saúde da mosca.
4. Limpe cuidadosamente a graxa e a cola não cicatrizada com um tecido de laboratório.
5. Coloque ~1 mL de soro fisiológico em cima da cabeça. Empurre as bolhas de ar de lado com fórceps. Procure vazamentos colocando uma mancha sobre o soro fisiológico e virando o suporte para verificar se há soro fisiológico na parte frontal. Se houver algum vazamento, remova o soro fisiológico e fixe o orifício (adicionando mais cola ou mais graxa).
   NOTA: Este pode ser um bom momento para pausar, se necessário. A mosca pode ser oferecida um pequeno pedaço de tecido ou bola de isopor para andar para evitar flailing e acalmar a mosca para baixo.

6. Dissecando a cabeça

NOTA: Use fórceps aguçados para as seguintes etapas. Fórceps muito finos são críticos, pois fórceps maçante tornarão mais difícil abrir a cutícula da cabeça e podem levar a lesões adicionais na cabeça ou cérebro da mosca. A ampliação forte pode ajudar nesta fase. Para esse objetivo, pode-se substituir os oculares do microscópio binóculo por oculares de 30x.

1. Faça dois cortes na base do triângulo cuticular escuro central em cada lado do pescoço (ver cruzes na Figura 8A).
2. Corte ao redor do triângulo escuro e remova esta parte da cutícula.
3. O buraco no cérebro através do qual o músculo 16 e o esôfago vão agora deve ser visível e mover-se ritmicamente (Vídeo 1 apresenta esse movimento rítmico em uma mosca com músculos fluorescentes). Belisque cuidadosamente a parte superior desta área para cortar o músculo 16 sem perfurar o esôfago. Se o movimento rítmico do cérebro parou, o músculo 16 provavelmente foi removido, no entanto, o movimento às vezes pausa e reinicia mais tarde. Por isso, é importante prestar atenção aos movimentos rítmicos e realizar esse passo novamente, se necessário.
4. Corte a cutícula restante em pequenos pedaços e remova-as cuidadosamente. Tente não puxar muito a cutícula. Em vez disso, use os fórceps como uma tesoura, para cortar pedaços de tecido. Pode-se começar nas bordas medial, onde o triângulo escuro foi removido antes e trabalhar o caminho para os lados.
   NOTA: Pedaços de cutícula podem ser usados para raspar suavemente corpos de gordura se presentes.
5. Remova os sacos de ar uma peça após a outra, agarrando-os com os fórceps e puxando lentamente e de forma constante.

Resultados

A preparação descrita acima permite a observação de todo o cérebro sob um microscópio para imagens 3D em larga escala, como fótons clássicos 2 ou microscopia confocal, mas também técnicas mais rápidas, como a folha de luz³¹ e outras técnicas estruturadas de microscopia de iluminação (revisada em³²), ou microscopia de campo leve²⁸.

O acesso a todo o cérebro observando o comportamento e mantendo órgãos sensoriais funcionais permite responder a várias perguntas.

Primeiro, qual é a atividade cerebral geral quando a mosca está em repouso, durante o comportamento, e quando ela responde a estímulos? Como exemplo, incluímos dados obtidos com um microscópio de campo leve mostrando a ativação cerebral durante respostas a estímulos e comportamentos. Por exemplo, no Vídeo 2,uma sonda de cálcio foi expressa em todos os neurônios (nsyb-GAL4 e UAS-syt-GCaMP6s (esquerda) ou UAS-GCaMP6M (direita)) e um sopro de odor foi apresentado. Observe como a preparação permite obter uma visão geral da atividade cerebral durante a resposta ao estímulo. As poderosas ferramentas genéticas em Drosophila podem ser usadas para restringir a expressão desses sensores a subtipos neuronais específicos. No Vídeo 3,restringimos a expressão de um sensor de cálcio a neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos (TH-GAL4, DDC-GAL4 e UAS-GCaMP6M). Observe a forte atividade síncronica sobre o cérebro fortemente correlacionada com a mosca andando, permitida observando todo o cérebro durante o comportamento. Além da atividade de cálcio, outros sinais físicos ou químicos podem ser imagens (utilizando, por^exemplo,sensores para tensão²⁸,³³, produtos metabolismos^34,35 ou neuromoduladores específicos³⁶).

Para entender o papel da atividade cerebral de forma mais especifica, podemos perguntar quais regiões estão envolvidas em que comportamento, resposta a estímulos ou padrões espontâneos de atividade. Os dados podem de fato ser usados como uma tela imparcial para extrair regiões funcionais usando técnicas como análise de componentes principais e análise de componentes independentes. A Figura 9A mostra diferentes regiões funcionais em cores diferentes. A forma e localização das regiões funcionais permitem mapeá-las para modelos anatômicos para identificar regiões cerebrais e, em alguns casos, tipo de neurônio. Além disso, uma vez alinhados ao modelo anatômico, os valores de fluorescência podem ser mediados em regiões cerebrais anatômicas para análise quantitativa (ver Figura 9B). Por exemplo, um modelo gaussiano hierárquico aplicado aos dados na Figura 9B mostra que as regiões são mais ativas durante a caminhada (com uma mediana ΔF/F de 0,029, Intervalo 95% crível=[0,017 0,041]) mas não durante o noivo (mediana ΔF/F = -0,0049 com intervalo 95% crível=[-0,016 0,0059]).

Somando-se à profundidade de compreensão, as gravações simultâneas das diferentes regiões funcionais permitidas pela preparação podem ser utilizadas para estudar as propriedades dinâmicas da rede funcional. Isso é importante porque as regiões cerebrais em todos os cérebros estudados até agora são altamente recorrentemente interconectadas e cada vez mais estudos mostram que mesmo áreas sensoriais respondem ao estado comportamental do animal. Vários aspectos podem ser analisados, como propriedades de gráficos funcionais (por exemplo, módulos) e padrões espáteris-temporais que podem ser adequados com sistemas dinâmicos (ver⁸ por exemplo).

Figura 1: Preparando o titular (passo 1). A) Design do suporte (vista a partir da parte superior). B) Preparação do slot do pescoço. topo: design de fita, fundo: lâminas paralelas usadas para cortar a ranhura do pescoço. C) Vista do suporte de baixo. D) Vista inferior indicando onde adicionar a fita do entalhe do pescoço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Preparativos adicionais (etapa 1). A) Adicione graxa na fenda do pescoço para evitar a cola para cobrir a parte de trás da cabeça e evitar vazamentos salinos. Barras de escala, 1 mm. B) Topo: forma da peça de fita que será usada para empurrar o corpo para baixo. Inferior: certifique-se de que a fita se encaixa no suporte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Colocação de uma fita em forma de V para auxiliar o centro. (A) Vista inferior. (B) Vista superior. Barra de escala, 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Coloque a mosca (passo 2). À esquerda, use dois fórceps maçante para colocar o corpo para que o pescoço esteja na fenda do pescoço. No meio, alinhe a cabeça. Os olhos estão em ambos os lados nas bordas da fenda. A cabeça da mosca está reta. Certo, coloque a mosca com um tecido coberto de gelo para evitar que ela se mova. Barra de escala, 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fixar a cabeça (passo 3). A) Ângulo ideal da cabeça. B) Adicione cola UV ao redor da cabeça, evitando áreas sensoriais de interesse. Barra de escala, 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A ponta do proboscis e as antenas podem ser mantidas livres de cola (passo 3). O círculo branco indica a área onde a cola UV foi aplicada. A seta mostra quais partes são deixadas livres de cola para experimentos olfativos e gustativos. Observe a fita opcional que impede que as pernas toquem na área da cola. Barra de escala, 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Coloque a fita traseira (passo 4.2). A fita criada na etapa 1 (ver Figura 2, esquerda) é usada para colocar o corpo e cobrir o grande orifício no suporte. Barra de escala, 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Etapas de dissecação (etapa 6). A-B) Corte em cada lado na base do triângulo escuro (cruzes) e remova esta parte da cutícula C). D) e E) removam o músculo 16. Em seguida, remova suavemente o resto da cutícula F, os sacos de ar G), e músculos. H) Cabeça dissecada. Barra de escala, 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Resultados representativos. A) Regiões funcionais (extraídas usando PCA e ICA como em²⁸) para uma mosca expressando GCaMP6 pan-neuronalmente imagens com um microscópio de campo leve (25x, NA=0,95 com uma matriz de lentes de microsetos f/12 correspondente). Barra de escala, 100 μm. B) Atividade média de cálcio em grandes regiões cerebrais durante respostas a estímulos e comportamento (reproduzido a partir de²⁸). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Movimentos musculares 16 (passo 6.3). A GFP foi expressa em músculos. Observe o movimento de bombeamento que vem do orifício logo acima da traqueia. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Atividade pan-neuronal de cálcio durante a resposta ao odor para duas preparações diferentes. Vinagre balsâmico foi soprado na mosca. A atividade pan-neuronal de cálcio (driver nsyb-GAL4, UAS-syt-GCaMP6s esquerda e UAS-GCaMP6M à direita) foi imagem com um microscópio de campo leve (25x, NA=0,95 com uma matriz de microlens f/12 correspondente). As imagens de campo de luz foram então reconstruídas como descrito no ref.^28,37. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Atividade de cálcio em um subconjunto do tipo neurônio durante o comportamento. GCaMP6 foi expresso em neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos (com TH-GAL4 e DDC-GAL4). Em combinação com as ferramentas genéticas da mosca, a preparação permite observar um forte aumento da atividade em muitas regiões durante a caminhada. Clique aqui para baixar este vídeo.

Material Suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Drosophila é um dos raros animais adultos onde todo o cérebro pode ser imagen durante comportamentos complexos. Aqui, apresentamos um método para preparar a mosca e expor todo o seu cérebro à imagem de toda a atividade cerebral. Vários pontos importantes devem ser observados.

Dissecar um pequeno animal como D. melanogaster é um desafio. O método, portanto, requer muita prática e paciência para dominá-lo. No entanto, após o treinamento, o procedimento leva menos de 30 minutos e produz resultados reprodutíveis.

O método que apresentamos tem limitações adicionais. Primeiro, inclinar a cabeça de mosca de sua posição natural leva ao alongamento do pescoço que pode ser prejudicial ao tecido conjuntivo, nervos ou músculo. Em segundo lugar, embora a zona subesofágica ventral (SEZ) seja opticamente acessível, está abaixo do esôfago semitranspar transparent, o que diminui a intensidade e a resolução nesta área. Finalmente, embora o titular esteja fora de alcance na maioria das direções, a mosca ainda às vezes percebe sua presença e empurra sobre ele para tentar escapar.

Apesar dessas limitações, os dados abrangentes obtidos de imagens cerebrais inteiras durante o comportamento e respostas a estímulos permitirão decifrar a função cerebral ao nível de toda a rede quando o animal interagir e navegar em ambientes complexos e naturalistas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	FST by DUMONT	11252-30	straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long
#55 forceps	FST by DUMONT	11255-20	straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long
30x oculars	yegren	WF30-9-30-H	WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle
AHOME/UV flashlight	Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd	B07V2W9543 (ASIN)	365 nm
Fotoplast Gel/UV Glue	Dreve Otoplastik GmbH	44791	GHS07, GHS08
Gloss Finish Transparent Tape	3M Scotch
KIMTECH Science/Precision wipes	Kimberly-Clark Professional	7552	11 x 21 cm
KL 1500 LCD/Microscope light	Schott
Leica MS5 Microscope	Leica		WF30X/9
Nail Lacqueur	Opi Products Inc., N. Hollywood	6306585338	black
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose	Sigma Aldrich
Scalpel	Werner Dorsch GmbH	78 621; B07SXCXWFS (ASIN)	soft handle
Vacuum grease	Dow corning	0020080 /100 gr	Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g