用于骨髓来源巨噬细胞分离、培养、极化和糖酵解表征的全面高效方案

摘要

该方案为活骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 的分离、培养、极化和糖酵解代谢状态的测量提供了详细而全面的方法。本文为实时 BMDM 的工作流程和糖酵解评估提供了带有逼真视觉插图的分步说明。

摘要

巨噬细胞是最重要的抗原呈递细胞之一。巨噬细胞的许多亚群已被鉴定为具有独特的代谢特征。巨噬细胞通常分为 M1 样（炎症）和 M2 样（抗炎）亚型。M1样巨噬细胞是促炎巨噬细胞，被LPS和/或促炎细胞因子如INF-γ、IL-12和IL-2激活。M1 样极化巨噬细胞通过介导宿主对多种细菌和病毒的防御而参与各种疾病。这对于研究 LPS 诱导的 M1 样巨噬细胞及其在炎症性疾病中的代谢状态非常重要。M2 样巨噬细胞被认为是抗炎巨噬细胞，由抗炎细胞因子和刺激剂激活。在促炎状态下，巨噬细胞在糖酵解功能中表现出糖酵解增加。使用细胞外通量 （XF） 分析仪在糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备、补偿性糖酵解或非糖酵解酸化的背景下，已经积极研究了糖酵解功能。

本文演示了当骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 呼吸、消耗和产生能量时，如何通过易于遵循的步骤实时评估糖酵解状态。在该方案中使用糖酵解的特异性抑制剂和激活剂，我们展示了如何获得细胞中糖酵解代谢过程的系统和完整视图，并提供更准确和真实的结果。为了能够测量多种糖酵解表型，我们提供了一种简单、灵敏、基于 DNA 的标准化方法，用于 BMDM 的极化评估。BMDM 表型和代谢状态的培养、激活/极化和鉴定是有助于研究许多不同类型疾病的关键技术。

在本文中，我们用 LPS 和 IL4 分别将幼稚的 M0 巨噬细胞极化为 M1 样和 M2 样巨噬细胞，并使用细胞外通量分析和糖酵解激活剂和抑制剂实时和纵向测量 BMDM 中的一组全面的糖酵解参数随时间变化。

引言

巨噬细胞是先天免疫系统 M1 样细胞中最关键的细胞之一。它们参与清除传染病、吞噬作用、抗原呈递和炎症调节²。此外，巨噬细胞需要通过它们释放的各种细胞因子来调节其他免疫细胞³。巨噬细胞表型的谱很广⁴。根据巨噬细胞暴露的信号，它们会朝着不同的炎症和代谢状态极化⁵。巨噬细胞在各种疾病中表现出代谢改变，具体取决于巨噬细胞所在的组织⁶。极化巨噬细胞具有重编程或转换其糖酵解代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和线粒体氧化磷酸化 （OXPHOS） 的能力^7,8。经典激活的 M1 样巨噬细胞和选择性激活的 M2 样巨噬细胞是研究最多的两种巨噬细胞表型³。未活化的静止巨噬细胞被称为 M0 巨噬细胞。M0 巨噬细胞向 M1 样表型的极化可以通过用细菌脂多糖 （LPS^{） 刺激}幼稚 BMDM 来诱导9。在炎性细胞因子、干扰素-γ （IFN γ） 或肿瘤坏死因子 （TNF） 存在下，PI3K-AKT-mTOR-HIF1a 信号通路可在巨噬细胞中被激活¹⁰。M1 样巨噬细胞糖酵解代谢水平升高，氧化磷酸化 （OXPHOS） 水平降低，产生参与感染和炎症性疾病的炎性细胞因子⁸。另一方面，白细胞介素 （IL）-4 可通过 JAK-STAT、PPAR 和 AMPK 通路或 （IL）-13 和 TGFβ 通路诱导向 M2 样表型的极化^11,12。

与 M1 样巨噬细胞相比，M2 样巨噬细胞的糖酵解降低，OXPHOS 增加，并参与抗寄生虫和组织修复活性 ^8,13。BMDM 是一种广泛用于研究源自骨髓干细胞的巨噬细胞的系统。糖酵解和 OXPHOS 是细胞中的两种主要能量产生途径¹⁴。根据它们的微环境，BMDM 可以选择使用这些途径中的任何一种;在某些情况下，从一种途径切换到另一种途径，或同时使用两种途径¹⁴。在这项研究中，我们专注于活化的促炎巨噬细胞中的糖酵解代谢。当细胞质中的葡萄糖转化为丙酮酸，然后转化为乳酸时，细胞会在培养基中产生质子，从而导致 M1 样细胞周围培养基中的酸化速率升高⁵。使用细胞外通量分析仪测量细胞培养基的酸化速率。结果报告为细胞外酸化率 （ECAR） 或质子流出率。

一种优化的快速简便的方法来获取极化巨噬细胞中的糖酵解水平，对于确定糖酵解表型、代谢物变化以及抑制剂/激活剂和药物对极化巨噬细胞的影响至关重要。本手稿中描述的方法已经过优化，可提供有关特定糖酵解因子（糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备和非糖酵解酸化）以及糖酵解代谢的代谢重编程的信息。本研究中使用的抑制剂 （2DG） 明确靶向糖酵解途径。

该优化的方案已根据已发布的方案¹⁶、制造商用户指南的糖酵解测定的细胞外通量分析以及与制造商研发科学家的直接沟通相结合进行了修改和改进。

研究方案

根据实验动物护理评估和认证 （AAALAC） 和美国实验动物科学协会 （AALAS） 指南，并使用德克萨斯 A&M 大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的方案，对小鼠进行人道处死。

1. 小鼠骨髓采集和 BMDMs 培养

1. 牺牲小鼠（6-10 周龄的 C57Bl/6 小鼠在该方案中）并将其放在腹侧，切开皮肤和腹膜层，轻轻剥下腿部。
   注意：使用 CO₂ 气体暴露对鼠标实施安乐死。
2. 将两条后腿与臀部以下分开，注意不要割伤骨头。
3. 将整条腿放入冰上的 50 mL 空锥形管中（脚朝上，以便稍后轻松拉出），然后继续从小鼠身上收获两条腿。

2. 股骨暴露

注意：在生物安全柜中执行以下步骤。

1. 通过切断每条腿的胫骨来收获股骨，并用剪刀和实验室纸去除尽可能多的股骨周围的组织。
2. 将收获的、“清洁”的股骨放入一个 10 cm 的板中，该板含有一张用组织培养 （TC） 培养基或 PBS 饱和的实验室纸。将它们放在冰上。
3. 在进入冲洗阶段之前，继续收获股骨并从所有股骨中取出组织（图 1A）。

3. 骨髓冲洗

1. 要从股骨中冲洗骨髓，请使用装有 TC 培养基或 PBS 的 3 mL 注射器和 23G 针头。在暴露骨髓之前填充注射器。
2. 用剪刀剪断两个骨骺处的股骨末端，露出骨髓。
3. 将针尖插入股骨，轻轻地将骨髓冲洗到 10 厘米的培养皿中。
4. 将针头穿过股骨的整个长度，并冲洗，直到骨骼颜色变为白色。通常，大多数骨髓可以用 2-3 mL 的培养基冲洗掉。
5. 冲洗所有股骨并汇集培养皿中的骨髓。使用针打碎任何可见的团块。将骨髓过滤到 50 mL 锥形管中（图 1A）。

4. 红细胞裂解

1. 以 190 x g 旋转骨髓 10 分钟。吸出上清液。
2. 用移液管将沉淀重悬于 4 mL ACK 裂解缓冲液中。让 RBC 裂解缓冲液在室温下工作 5 分钟。
3. 向骨髓悬液中加入 4 mL 补充有 2-巯基乙醇、庆大霉素、链霉素和 10% FCS 的 TC 培养基 RPMI-C 10% （RPMI 1640 -GlutaMAX），并以 1300 x g 离心 10 分钟。
4. 再次过滤以去除 RBC 碎片，并重新悬浮在少量 RPMI-C 10% 中进行计数。
5. 用细胞计数器计数细胞（图 1B）。使用 Vi-Cell Counter 测定悬浮液中细胞的数量和活力。

5. 电镀和培养

1. 根据需要将 10 mL RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子，单核细胞/巨噬细胞增殖、分化和存活的重要调节因子）添加到任意数量的 10 cm 板中。
2. 添加适当体积的计数细胞，使每个 10 cm 板包含 1 x 10⁶ 个细胞。将板放入 37 °C 培养箱中（定义为第 0 天）。
3. 第 3 天，向每个板中轻轻加入 5 mL 新鲜 RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF。
   注意：第 7 天，BMDM 应该准备好进行测试（图 1C）。

6. 从盘子里收获

1. 使用光学显微镜确认大多数细胞已粘附在板上。
2. 轻轻吸出培养基。然后加入 3 mL PBS 并轻轻旋转板。充分吸出以去除任何剩余的非贴壁细胞。
3. 向板中加入 7-10 mL 冷 PBS，使用 P1000 移液器清洗板底部，并将所有剩余细胞收获到收集管中。
   注意：将试管放在冰上，因为巨噬细胞非常紧密地粘附在试管内部。如果细胞保持低温，它们的粘附性就会降低。
4. 离心、计数和铺板细胞用于实验（图 1D）。使用流式细胞术，所得细胞的 CD11b 和 F4/80 阳性应为 >95%。（通过用 CD38 、 TNF-a 和 MCP-1 的 M1 样标志物以及 CD206 的 M2 样标志物染色来确定巨噬细胞极化。
   注：在生物安全柜中执行步骤 6.1-6.3，在工作台上执行步骤 6.4。在整个手术过程中保持无菌技术。

图 1：BM 来源的巨噬细胞小鼠骨髓培养的图形工作流程。 （A） 腿部收获、股骨暴露和骨髓冲洗; （B） 红细胞裂解; （C） 铺板和培养; （D） 从平板中收获的细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。

7. 代谢通量分析仪测定前一天：用于糖酵解试验的细胞的接种和极化

1. 打开仪器，将代谢通量分析仪预热至 37 °C。
2. 通过添加 200 μL 校准液来水合小柱，并将小柱在非 CO₂ 培养箱中孵育过夜（图 2A）。非 CO₂ 培养箱的湿度对于小柱水合并不重要。
   1. 实验前一小时，将板上下浸泡几次，这将有助于去除气泡。
3. 按照测试的说明，在默认的糖酵解应激测试-急性注射中的软件上设计板图。
   1. 单击软件图标，然后单击 Glycolysis stress-acute injection test。在组定义图标上，生成组名称。
4. 有 5 个测量周期，持续时间为 18 分钟，注射 4 次。将端口 A 的注射更改为葡萄糖，将端口 B 更改为寡霉素，将端口 C 更改为鱼藤酮和抗霉素 A （Rot/AA），将端口 D 更改为 2DG。
5. 将细胞重悬于 RPMI-C 10% 培养基中，每孔接种 50k 细胞，板的四个边缘（A1、A12、H1 和 H12;仅添加培养基，不添加细胞）至最终体积为 100 μL。通常至少需要 40k 个细胞才能进行此检测。
6. 让细胞在室温下静置 45 分钟，以避免细胞的边缘效应。边缘效应是指板周边的培养基部分蒸发，这会导致体积和浓度发生变化并降低细胞活力。
7. 添加 10 ng/mL LPS 以将初始巨噬细胞极化至 M1 样细胞，并添加 20 ng/ml IL-4 以将它们极化至 M2 样细胞。每个条件至少使用 3 到 6 个孔（图 2B）。
8. 在显微镜下检查细胞，并将板置于 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中 24 小时。

图 2：细胞接种和极化的图形演示。 （A） 细胞外通量分析仪设置和小柱水合; （B） 细胞极化和过夜孵育。 请单击此处查看此图的较大版本。

8. 检测日期：XF 培养基和化合物制备

1. 用 2 mM 谷氨酰胺补充 100 mL XF RPMI （pH 7.4） 分析培养基。
2. 使用 0.2 μm 真空过滤系统对培养基进行过滤消毒。
3. 将检测培养基置于 37^°C 水浴中 20 分钟。
4. 从 37 °C、5% CO₂ 培养箱中取出铺板的细胞。用检测培养基洗涤细胞两次，并用检测培养基替换之前的培养基，最终体积为 180 μL。
5. 使用显微镜确保所有孔都有汇合细胞，并标记任何因移液而有划痕的孔。如果有任何划痕，请在分析前取下该板。
6. 将含有细胞的板放置在非 CO₂ 培养箱中 45 分钟（图 3A）。
7. 使用化合物和测定培养基制备葡萄糖 （100 mM）、寡霉素 （100 μM）、Rot/AA （50 μM） 和 2DG （500 mM） 的储备溶液（表 1）。
8. 使用测定培养基制备每种化合物的 10 倍注射混合物（表 2）。

注射液（在试剂盒中提供）	添加完全检测培养基 （mL）	最终储备液浓度 （μM）
葡萄糖	3	100K
寡霉素	0.72	100
2-DG	3	100 千米

表 1.注射原料

磁带上的端口	Stock 解决方案	添加毛坯体积	添加检测培养基	注射的最终浓度 （10x）	将此体积添加到指定端口 （μL）	每个孔中进样后的最终浓度
一个	葡萄糖 （100 mM）	3000 微升 + 0 微升		100 毫米	20	10 毫米
B	寡霉素 （100 μM）	300 μL + 2700 μL		10 微米	22	1.0 微米
C	鱼藤酮/抗霉素 A （50 μM）	300 μL + 2700 μL		5 微米	25	0.5 微米
D	2-DG （500 毫米）	300 μL + 0 μL		500 毫米	28	50 毫米

表 2.最终进样浓度

9. 检测当天：对极化巨噬细胞进行急性糖酵解试验

1. 从软件中打开保存的糖酵解应激测定（急性注射）模板。默认的急性糖酵素应激测试在每次注射前有 3 分钟的混合和测量。
2. 检查模板和检测详细信息，准备就绪后，单击 Run（运行）并按照默认检测的说明进行作。但是，所有参数都可以自定义。
3. 从非 CO₂ 培养箱中取出传感器柱，取下盖子，然后插入仪器，使柱板的 A1 孔落入机器插入面板的左上角。通常，校准需要 20 到 45 分钟。
4. 完成校准后，设备将弹出含有校准液的板并固定传感器探针板。取出含有板的校准液。
5. 从非 CO₂ 培养箱中取出细胞板，取下板盖，然后将其插入机器中。单击运行（图 3B）。
6. 检测完成后，机器将弹出细胞板和传感器盒。
7. 从板中取出培养基并在-20°C下冷冻以进行进一步归一化。
8. 使用市售细胞增殖检测试剂盒（例如 CyQUANT）对细胞进行标准化。
9. 将 1 mL 化合物 B 或裂解缓冲液添加到 19 mL 无核酸酶蒸馏水中。
10. 向上述溶液中加入 100 μL 化合物 A 或 GR 工作溶液。
11. 确保板中的细胞已解冻，然后向每个孔中加入 200 μL 溶液。
12. 在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
13. 使用读板器测量 480 nm 激发波长和 520 nm 发射波长的荧光。
14. 在软件的标准化面板上标准化细胞。
15. 根据幼稚巨噬细胞细胞计数标准化细胞（图 3C）。将幼稚巨噬细胞的平均值视为 1（通过将每个孔的细胞数除以幼稚巨噬细胞的平均细胞数）并将它们应用于所有巨噬细胞。

图 3：检测日期：培养基和化合物制备以及运行检测。 （A） 用于检测的细胞制备; （B） 化合物制备、校准和运行分析; （C） 标准化和数据分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

结果

糖酵解和线粒体氧化磷酸化是细胞中 ATP 产生的两个主要途径（图 4A）。一些细胞能够在这两种途径之间切换以满足其能量需求。葡萄糖在细胞质中转化为丙酮酸称为糖酵解。丙酮酸有两种命运;它要么转化为乳酸，要么通过 TCA 循环进一步代谢，最终通过电子传递链 （ETC） 产生更多的 ATP。为了最好地了解细胞的糖酵解参数?...

讨论

如前所述，细胞外通量分析仪可以通过测量 OCR（耗氧率）（线粒体 OXPHOS 活性的指标）和 ECAR（细胞外酸化率）（糖酵解的指标）来提供有关细胞两个主要能量产生途径的实时信息。巨噬细胞可以使用这两种途径，具体取决于它们的微环境。它们还可以改变能量产生途径^17,18。了解巨噬细胞的能量状态及其对不同药物、细胞因子...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100