骨髄由来マクロファージの単離、培養、分極、および解糖特性評価のための包括的で高効率なプロトコール

要約

このプロトコルは、生きた骨髄由来マクロファージ(BMDM)の解糖代謝状態の単離、培養、分極、および測定のための詳細かつ包括的な方法を提供します。このホワイトペーパーでは、BMDMのワークフローと解糖評価をリアルタイムで行うための現実的な視覚的イラストを使用して、ステップバイステップの説明を提供します。

要約

マクロファージは、最も重要な抗原提示細胞の一つです。マクロファージの多くのサブセットは、独自の代謝シグネチャーで同定されています。マクロファージは、一般的にM1様(炎症性)およびM2様(抗炎症性)のサブタイプに分類されます。M1様マクロファージは、LPSおよび/またはINF-γ、IL-12、IL-2などの炎症誘発性サイトカインによって活性化される炎症誘発性マクロファージです。M1様分極マクロファージは、さまざまな細菌やウイルスに対する宿主の防御を媒介することにより、さまざまな病気に関与しています。これは、LPS誘導性M1様マクロファージとその炎症性疾患における代謝状態を研究するために非常に重要です。M2様マクロファージは、抗炎症性サイトカインおよび刺激物質によって活性化される抗炎症性マクロファージと考えられています。炎症誘発性状態では、マクロファージは解糖機能において解糖系の増加を示します。解糖機能は、解糖、解糖能、解糖リザーブ、代償性解糖、または細胞外フラックス(XF)分析装置を使用した非解糖酸性化の文脈で積極的に研究されてきました。

この論文では、骨髄由来マクロファージ(BMDM)が呼吸し、エネルギーを消費し、生成しているときに、わかりやすい手順で解糖状態をリアルタイムで評価する方法を示します。このプロトコルでは、解糖系の特異的阻害剤および活性化剤を使用して、細胞内の解糖代謝過程の全身的かつ完全なビューを取得し、より正確で現実的な結果を提供する方法を示します。複数の解糖表現型を測定できるようにするために、BMDMの分極評価のための簡単で高感度なDNAベースの正規化法を提供します。BMDMの培養、活性化/分極、表現型と代謝状態の同定は、さまざまな種類の疾患の調査に役立つ重要な技術です。

この論文では、ナイーブなM0マクロファージをLPSおよびIL4でそれぞれM1様マクロファージおよびM2様マクロファージに分極し、細胞外フラックス分析と解糖活性化剤および阻害剤を使用して、BMDMの解糖パラメータの包括的なセットをリアルタイムおよび経時的に測定しました。

概要

マクロファージは、自然免疫系M1様の最も重要な細胞の1つです。彼らは感染症の除去、食作用、抗原提示、および炎症調節^{に関与しています2}。さらに、マクロファージは、放出するさまざまなサイトカインを介して他の免疫細胞を調節する必要があります³。マクロファージの表現型には大きなスペクトルがあります⁴。マクロファージがさらされるシグナルに応じて、マクロファージはさまざまな炎症状態と代謝状態に向かって分極します⁵。マクロファージは、マクロファージがどの組織に存在するかによって、さまざまな疾患で代謝変化を示します⁶。分極されたマクロファージは、解糖代謝、脂質代謝、アミノ酸代謝、およびミトコンドリア酸化的リン酸化(OXPHOS^)7,8を再プログラムまたは切り替える能力を持っています。古典的に活性化されたM1様マクロファージと代替的に活性化されたM2様マクロファージは、マクロ^{ファージ3}の最も研究された表現型の2つです。非活性化静止マクロファージは、M0マクロファージと呼ばれます。M0マクロファージのM1様表現型への分極は、細菌性リポ多糖(LPS⁾⁹によるナイーブBMDMの刺激によって誘導され得る。PI3K-AKT-mTOR-HIF1aシグナル伝達経路は、炎症性サイトカイン、インターフェロン-γ(IFN γ)または腫瘍壊死因子(TNF)の存在下でマクロファージで活性化できます¹⁰。M1様マクロファージは、解糖代謝のレベルが上昇し、酸化的リン酸化(OXPHOS)のレベルが低下し、感染性疾患や炎症性疾患に関与する炎症性サイトカインを産生します⁸。一方、M2様表現型への分極は、インターロイキン(IL)-4によってJAK-STAT、PPAR、およびAMPK経路を介して、または(IL)-13およびTGFβ経路^11,12によって誘導され得る。

M1様マクロファージとは対照的に、M2様マクロファージは解糖系を減少させ、OXPHOSを増加させ、抗寄生虫および組織^{修復活性に関与し}ている^8,13。BMDMは、骨髄幹細胞に由来するマクロファージの研究に広く使用されているシステムです。解糖系とOXPHOSは、細胞内の2つの主要なエネルギー生産経路である¹⁴。BMDMは、その微小環境に基づいて、これらの経路のいずれかを使用することを選択できます。場合によっては、一方から他方に切り替えるか、または両方の経路を使用します¹⁴。本研究では、活性化炎症誘発性マクロファージにおける解糖代謝に着目しました。細胞質内のグルコースがピルビン酸に変換され、次に乳酸に変換されると、細胞は培地内でプロトンを生成し、M1様細胞の周囲の培地で酸性化速度の上昇を引き起こします⁵。細胞外フラックス分析装置を使用して、細胞培地の酸性化速度を測定しました。結果は、細胞外酸性化率(ECAR)または陽子排出率として報告されます。

分極性マクロファージの解糖系レベルにアクセスするための最適化された迅速かつ簡単な方法は、解糖の表現型、代謝物の変化、および分極性マクロファージに対する阻害剤/活性化剤および薬物の影響を決定するために不可欠です。この原稿で説明されている方法は、特定の解糖因子(解糖、解糖能、解糖予備、および非解糖酸性化)に関する情報、および解糖代謝の代謝リプログラミングに関する情報を提供するように最適化されています。この研究で使用された阻害剤 (2DG) は、解糖経路を明示的に標的としています。

この最適化されたプロトコルは、公開されたプロトコル¹⁶、メーカーのユーザーガイドの解糖アッセイの細胞外フラックス分析、およびメーカーのR&D科学者との直接のコミュニケーションの組み合わせに基づいて変更および改善されています。

プロトコル

マウスは、Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)およびAmerican Association for Laboratory Animal Science(AALAS)のガイドラインに従って、テキサスA&M大学の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルを使用して、人道的に犠牲にされました。

1. マウスの骨髄採取とBMDMの培養

1. 犠牲マウス(このプロトコルにはC57Bl/6匹のマウスが6-10週齢)を生け贄に置き、腹側に置き、皮膚と腹膜層を切断し、脚をそっと剥がします。
   注意: マウスを安楽死させるには、CO₂ ガス曝露を使用してください。
2. 骨を切らないように注意しながら、両後ろ足を腰から下に分けます。
3. 氷の上の空の50mLコニカルチューブ(足を上に向けて、後で引き出すのが簡単なように)に脚全体を置き、マウスから両脚を採取します。

2.大腿骨の露出

注意: バイオセーフティキャビネットで次の手順を実行します。

1. 各脚から脛骨を切り取って大腿骨を採取し、はさみと実験紙で大腿骨の周囲の組織をできるだけ多く取り除きます。
2. 採取した大腿骨を、組織培養(TC)培地またはPBSで飽和させた実験紙を含む10cmプレートに入れます。それらを氷の上に置きます。
3. 大腿骨の採取を続け、すべての大腿骨から組織を採取してから、フラッシング段階に進みます(図1A)。

3.骨髄フラッシュ

1. 大腿骨から骨髄を洗い流すには、TC培地またはPBSを充填した3mLシリンジと23G針を使用します。骨髄を露出させる前にシリンジを満たします。
2. はさみを使用して、両方の骨端で大腿骨の一番端を切って骨髄を露出させます。
3. 大腿骨に針先を挿入し、骨髄を10cmの皿にやさしく洗い流します。
4. 大腿骨の全長に針を通し、骨の色が白くなるまで洗い流します。通常、ほとんどの骨髄は2〜3mLの培地で洗い流すことができます。
5. すべての大腿骨を洗い流し、皿の中の骨髄をプールします。針を使用して、目に見える塊を分割します。骨髄を50 mLのコニカルチューブに濾します(図1A)。

4. RBC溶解

1. 骨髄を190 x gで10分間スピンします。上清を吸引します。
2. ペレットをピペットで4 mLのACK溶解バッファーに再懸濁します。RBC溶解バッファーを室温で5分間作動させます。
3. 2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、および10% FCSを添加したTC培地RPMI-C 10%(RPMI 1640 -GlutaMAX)4 mLを骨髄懸濁液に加え、1300 x gで10分間遠心します。
4. 再度濾してRBCの破片を取り除き、カウントのために少量のRPMI-C 10%に再懸濁します。
5. セルカウンターでセルをカウントします(図1B)。Vi-Cell Counterを使用して、懸濁液中の細胞の数と生存率を決定しました。

5. 盛り付けと培養

1. 10 mLのRPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF(Macrophage Colony Stimulating Factor、単球/マクロファージの増殖、分化、生存の必須調節因子)を必要な数の10 cmプレートに加えます。
2. 各10cmプレートに1 x 10⁶ 個のセルが含まれるように、適切な量のカウントセルを追加します。プレートを37°Cのインキュベーター(0日目と定義)に入れます。
3. 3日目に、各プレートに5 mLの新鮮なRPMI-C 10% + 10 ng/mlのM-CSFを静かに加えます。
   注:7日目には、BMDMはテストの準備ができているはずです(図1C)。

6.プレートから収穫する

1. 光学顕微鏡を用いて、ほとんどの細胞がプレートに付着していることを確認します。
2. メディアをやさしく吸引します。次に、3 mLのPBSを加え、プレートを静かに回転させます。このウェルを吸引して、残っている非接着性細胞を除去します。
3. 7〜10 mLの冷たいPBSをプレートに加え、P1000ピペットを使用してプレートの底を洗浄し、残りのすべての細胞をコレクションチューブに回収します。
   注:マクロファージは非常にしっかりと付着し、チューブの内側に付着するため、チューブを氷上に保管してください。細胞が冷たく保たれていれば、細胞の接着性は低下します。
4. 実験用の細胞を遠心分離、カウント、およびプレート化します(図1D)。フローサイトメトリーを使用すると、得られた細胞はCD11bおよびF4/80に対して>95%陽性であるはずです。(マクロファージの分極は、CD38、TNF-a、およびMCP-1のM1様マーカーとCD206のM2様マーカーで染色することにより決定しました。
   注意: バイオセーフティキャビネットで手順6.1〜6.3を実行し、ベンチトップで手順6.4を実行します。手順全体を通して無菌技術を維持します。

図1:BM由来マクロファージのマウス骨髄培養のグラフィカルワークフロー(A)脚の採取、大腿骨の曝露、および骨髄のフラッシュ;(B)RBCリシス;(C)メッキと文化;(D)プレートからの細胞回収。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7.代謝フラックスアナライザーアッセイの前日:解糖試験のための細胞の播種と分極

1. メタボリックフラックスアナライザーの電源を入れて、メタボリックフラックスアナライザーを37°Cにウォームアップします。
2. 200 μLのCalibrant溶液を加えてカートリッジを水和し、カートリッジを非_CO2 インキュベーターで一晩インキュベートします(図2A)。非_CO2 インキュベーターの湿度は、カートリッジの水分補給には重要ではありません。
   1. 実験の1時間前に、プレートを数回上下に沈めると、気泡を取り除くのに役立ちます。
3. デフォルトの解糖ストレス試験-急性注射のソフトウェアでプレートマップを設計し、テストの指示に従ってください。
   1. ソフトウェアのアイコンをクリックし、[ 解糖ストレス-急性注射テスト]をクリックします。グループ定義アイコンで、グループ名を生成します。
4. 測定サイクルは5回、所要時間は18分で、4回の注入があります。ポートAをグルコースに、ポートBをオリゴマイシンに、ポートCをロテノンとアンチマイシンA(Rot/AA)に、ポートDを2DGに変更します。
5. RPMI-C 10%培地で細胞を再懸濁し、プレートの4つの端（A1、A12、H1、H12;Metabolic Flux Analyzerマイクロプレートに培地のみ、細胞は加えません)を最終容量100 μLまで加えます。通常、このアッセイを行うには最低40k個の細胞が必要です。
6. 細胞のエッジ効果を避けるために、細胞を室温で45分間放置します。エッジ効果とは、プレートの周囲にある培地が部分的に蒸発し、体積と濃度が変化し、細胞の生存率が低下することです。
7. 10 ng/mL LPSを添加してナイーブマクロファージをM1様細胞に分極させ、20 ng/mLのIL-4を添加してM2様細胞に分極させます。条件ごとに少なくとも3〜6ウェルを使用します(図2B)。
8. 顕微鏡で細胞をチェックし、プレートを37°C、5%_CO2 のインキュベーターに24時間置きます。

図2:細胞の播種と分極のグラフィカルなデモンストレーション。 (A)細胞外フラックスアナライザーのセットアップとカートリッジの水分補給。 (B) 細胞の分極と一晩のインキュベーション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8. アッセイ当日:XF培地および化合物の調製

1. 100 mL の XF RPMI (pH 7.4) アッセイ培地を 2 mM グルタミンで補体します。
2. 0.2 μm真空フィルターシステムを使用して、メディアをフィルター滅菌します。
3. アッセイ培地を37^°Cのウォーターバスに20分間置きます。
4. 37°C、5%CO₂ インキュベーターから播種した細胞を取り出します。アッセイ培地で細胞を2回洗浄し、前の培地をアッセイ培地と交換して最終容量180μLにします。
5. 顕微鏡を使用して、すべてのウェルにコンフルエントセルがあることを確認し、ピペッティングによる傷のあるウェルに印を付けます。傷がある場合は、そのプレートを取り外してから分析してください。
6. 細胞含有プレートを非_CO2 インキュベーターに45分間配置します(図3A)。
7. 化合物とアッセイ培地を使用して、グルコース(100 mM)、オリゴマイシン(100 μM)、Rot/AA(50 μM)、2DG(500 mM)のストック溶液を作製します(表1)。
8. アッセイ培地を使用して、各化合物の10倍注射混合物を調製します(表2)。

インジェクションストック(キットに付属)	Complete assay 培地(mL)を添加します。	最終ストック濃度(μM)
グルコース	3	100キロメートル競走
オリゴマイシン	0.72	100
2-DGの	3	100キロメートル競走

テーブル 1.インジェクションストック

カートリッジのポート	ストックソリューション	ストックボリュームを追加	アッセイ培地の添加	注射剤の最終濃度 (10x)	この容量を指定ポートに追加(μL)	各ウェルへの注入後の最終濃度
ある	グルコース(100 mM)	3000 μL + 0 μL		100 mM	20	10 mM
B	オリゴマイシン (100 μM)	300 μL + 2700 μL		10 μM	22	1.0 μM
C	ロテノン/アンチマイシンA(50μM)	300 μL + 2700 μL		5 μM	25	0.5 μM
D	2-DG (500 mM)	300 μL + 0 μL		500 mM	28	50 mM

テーブル2.最終注入濃度

9. アッセイ当日:分極マクロファージの急性解糖試験の実施

1. 保存した解糖ストレスアッセイ(急性注射)テンプレートをソフトウェアから開きます。デフォルトの急性糖質ストレステストでは、各注入前に3分間の混合と測定が行われます。
2. テンプレートとアッセイの詳細を確認し、準備ができたら、Runをクリックしてデフォルトのアッセイの指示に従います。ただし、すべてのパラメーターをカスタマイズできます。
3. 非_CO2 インキュベーターからセンサーカートリッジを取り外し、蓋を取り外し、カートリッジプレートのA1ウェルがマシンの挿入パネルの左上隅に落ちるように装置に挿入します。通常、キャリブレーションには20〜45分かかります。
4. キャリブレーションが完了すると、デバイスはキャリブラント溶液を含むプレートを排出し、センサーカートリッジを保持します。プレートが入っているキャリブラントを取り外します。
5. 非_CO2 インキュベーターから細胞プレートを取り外し、プレートの蓋を取り外して、マシンに挿入します。[Run](実行)をクリックします(図3B)。
6. アッセイが完了すると、マシンはセルプレートとセンサーカートリッジを排出します。
7. プレートから培地を取り出し、-20°Cで凍結してさらに標準化します。
8. 市販の細胞増殖アッセイキット(CyQUANTなど)を使用して、細胞を標準化します。
9. 1 mLのコンパウンドBまたは溶解バッファーを19 mLのヌクレアーゼフリー蒸留水に加えます。
10. 上記の溶液に100 μLのコンパウンドAまたはGRワーキング溶液を加えます。
11. プレート内の細胞が解凍されていることを確認してから、各ウェルに200μLの溶液を加えます。
12. 室温(RT)で5分間インキュベートします。
13. プレートリーダーを使用して、480 nmの励起波長と520 nmの発光波長の蛍光を測定します。
14. ソフトウェアの正規化パネルでセルを正規化します。
15. ナイーブマクロファージの細胞数に基づいて細胞を正規化します(図3C)。ナイーブマクロファージの平均を1とし(各ウェルの細胞数をナイーブマクロファージの平均細胞数で割ることにより)、それらをすべてのマクロファージに適用します。

図3:アッセイの日:培地および化合物の調製とアッセイの実行(A)アッセイのための細胞調製;(B)化合物の調製、キャリブレーション、およびアッセイの実行。(C)正規化とデータ分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

解糖とミトコンドリアの酸化的リン酸化は、細胞内の2つの主要なATP産生経路です(図4A)。一部の細胞は、エネルギー需要を満たすためにこれら2つの経路を切り替える能力を持っています。細胞質内でのグルコースからピルビン酸への変換は、解糖系と呼ばれます。ピルビン酸には2つの運命があります。それは乳酸に変?...

ディスカッション

先述の通り、細胞外フラックス分析装置は、ミトコンドリアのOXPHOS活性の指標であるOCR(酸素消費率)と解糖の指標であるECAR(細胞外酸性化率)を測定することで、細胞の2つの主要なエネルギー産生経路に関する情報をリアルタイムに提供できます。マクロファージは、微小環境に応じて、両方の経路を使用できます。彼らはまた、エネルギー生産経路^を切...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100