Um protocolo abrangente de alta eficiência para isolamento, cultura, polarização e caracterização glicolítica de macrófagos derivados da medula óssea

Resumo

Este protocolo fornece métodos detalhados e abrangentes para o isolamento, cultura, polarização e medição do estado metabólico glicolítico de macrófagos vivos derivados da medula óssea (BMDMs). Este artigo fornece instruções passo a passo com ilustrações visuais realistas para fluxo de trabalho e avaliação glicolítica de BMDMs em tempo real.

Resumo

Os macrófagos estão entre as células apresentadoras de antígenos mais importantes. Muitos subconjuntos de macrófagos foram identificados com assinaturas metabólicas únicas. Os macrófagos são comumente classificados como subtipos semelhantes a M1 (inflamatórios) e semelhantes a M2 (antiinflamatórios). Macrófagos semelhantes a M1 são macrófagos pró-inflamatórios que são ativados por LPS e / ou citocinas pró-inflamatórias, como INF-γ, IL-12 e IL-2. Macrófagos polarizados do tipo M1 estão envolvidos em várias doenças, mediando a defesa do hospedeiro a uma variedade de bactérias e vírus. Isso é muito importante para estudar macrófagos semelhantes a M1 induzidos por LPS e seus estados metabólicos em doenças inflamatórias. Os macrófagos do tipo M2 são considerados macrófagos anti-inflamatórios, ativados por citocinas e estimuladores anti-inflamatórios. Sob o estado pró-inflamatório, os macrófagos apresentam glicólise aumentada na função glicolítica. A função glicolítica tem sido ativamente investigada no contexto de glicólise, capacidade glicolítica, reserva glicolítica, glicólise compensatória ou acidificação não glicolítica usando analisadores de fluxo extracelular (XF).

Este artigo demonstra como avaliar os estados glicolíticos em tempo real com etapas fáceis de seguir quando os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) estão respirando, consumindo e produzindo energia. Usando inibidores e ativadores específicos da glicólise neste protocolo, mostramos como obter uma visão sistêmica e completa dos processos metabólicos glicolíticos nas células e fornecer resultados mais precisos e realistas. Para poder medir vários fenótipos glicolíticos, fornecemos um método de normalização fácil, sensível e baseado em DNA para avaliação da polarização de BMDMs. Cultura, ativação/polarização e identificação do fenótipo e estado metabólico dos BMDMs são técnicas cruciais que podem ajudar a investigar muitos tipos diferentes de doenças.

Neste artigo, polarizamos os macrófagos M0 virgens para macrófagos semelhantes a M1 e M2 com LPS e IL4, respectivamente, e medimos um conjunto abrangente de parâmetros glicolíticos em BMDMs em tempo real e longitudinalmente ao longo do tempo, usando análise de fluxo extracelular e ativadores e inibidores glicolíticos.

Introdução

Os macrófagos são uma das células mais críticas do sistema imunológico inato semelhante ao M1. Eles estão envolvidos na eliminação de doenças infecciosas, fagocitose, apresentação de antígenos e regulação da inflamação². Além disso, os macrófagos são necessários para regular outras células imunes por meio de várias citocinas que liberam³. Existe um grande espectro nos fenótipos de macrófagos⁴. Dependendo dos sinais aos quais os macrófagos são expostos, eles se polarizam em direção a diferentes estados inflamatórios e metabólicos⁵. Os macrófagos manifestam alterações metabólicas em várias doenças, dependendo do tecido em que os macrófagos residem⁶. Os macrófagos polarizados têm a capacidade de reprogramar ou mudar seu metabolismo glicolítico, metabolismo lipídico, metabolismo de aminoácidos e fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS)^7,8. Macrófagos do tipo M1 classicamente ativados e macrófagos do tipo M2 ativados alternativamente são os dois fenótipos de macrófagos mais estudados³. Macrófagos quiescentes não ativados são chamados de macrófagos M0. A polarização de macrófagos M0 em direção a um fenótipo semelhante ao M1 pode ser induzida pela estimulação de BMDMs virgens com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS)⁹. A via de sinalização PI3K-AKT-mTOR-HIF1a pode ser ativada em macrófagos na presença de citocinas inflamatórias, interferon-gama (IFN γ) ou fator de necrose tumoral (TNF)¹⁰. Macrófagos semelhantes a M1 apresentam níveis aumentados de metabolismo da glicólise, diminuição dos níveis de fosforilação oxidativa (OXPHOS), produzindo citocinas inflamatórias envolvidas em doenças infecciosas e inflamatórias⁸. Por outro lado, a polarização em direção ao fenótipo M2-like pode ser induzida pela interleucina (IL)-4, através das vias JAK-STAT, PPAR e AMPK, ou pelas vias (IL)-13 e TGFβ^11,12.

Em contraste com os macrófagos semelhantes a M1, os macrófagos semelhantes a M2 diminuíram a glicólise e aumentaram o OXPHOS e estão envolvidos em atividades antiparasitárias e de reparo tecidual ^8,13. Os BMDMs são um sistema amplamente utilizado para o estudo de macrófagos derivados de células-tronco da medula óssea. A glicólise e o OXPHOS são as duas principais vias de produção de energia nas células¹⁴. Com base em seu microambiente, os BMDMs podem optar por usar qualquer uma dessas vias; em alguns casos, mude de um para outro ou use os dois caminhos¹⁴. Neste estudo, nos concentramos no metabolismo da glicólise em macrófagos pró-inflamatórios ativados. Quando a glicose no citoplasma é convertida em piruvato e depois em lactato, as células produzem prótons no meio que causam uma elevação na taxa de acidificação no meio cercado de células semelhantes a M1⁵. Um analisador de fluxo extracelular foi usado para medir a taxa de acidificação do meio celular. Os resultados são relatados como Taxa de Acidificação Extracelular (ECAR) ou como Taxa de Efluxo de Prótons.

Um método otimizado, rápido e fácil para acessar os níveis de glicólise em macrófagos polarizados é essencial para determinar o fenótipo glicolítico, alterações de metabólitos e os efeitos de inibidores / ativadores e drogas nos macrófagos polarizados. O método descrito neste manuscrito foi otimizado para fornecer informações sobre fatores específicos de glicólise (glicólise, capacidade glicolítica, reserva glicolítica e acidificação não glicolítica), bem como a reprogramação metabólica do metabolismo glicolítico. O inibidor (2DG) que foi usado neste estudo visa explicitamente a via da glicólise.

Este protocolo otimizado foi modificado e aprimorado com base na combinação de um protocolo publicado¹⁶, análise de fluxo extracelular de ensaios glicolíticos de guias do usuário do fabricante e comunicação direta com cientistas de P&D do fabricante.

Protocolo

Os camundongos foram sacrificados humanamente de acordo com as diretrizes de Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC) e Associação Americana de Ciência de Animais de Laboratório (AALAS) e usando protocolos aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Texas A&M University (IACUC).

1. Colheita de medula óssea de camundongos e cultura de BMDMs

1. Sacrifique o camundongo (camundongos C57Bl / 6 de 6 semanas de idade estavam neste protocolo) e coloque-o em seu lado ventral, corte a pele e a camada peritoneal e retire suavemente as pernas.
   NOTA: Use a exposição ao gás CO₂ para sacrificar o mouse.
2. Separe as duas patas traseiras do quadril para baixo, tomando cuidado para não cortar o osso.
3. Coloque a perna inteira em um tubo cônico vazio de 50 mL (com os pés voltados para cima para ter uma pegada fácil de puxar mais tarde) no gelo e prossiga com a colheita de ambas as pernas do mouse.

2. Exposição do fêmur

NOTA: Execute as etapas a seguir em um gabinete de biossegurança.

1. Colha o fêmur cortando a tíbia de cada perna e remova o máximo de tecido possível ao redor do fêmur com uma tesoura e papel de laboratório.
2. Coloque os fêmures colhidos e "limpos" em uma placa de 10 cm contendo um pedaço de papel de laboratório saturado com meio de cultura de tecidos (TC) ou PBS. Coloque-os no gelo.
3. Continue colhendo fêmures e removendo o tecido de todos os fêmures antes de prosseguir para o estágio de lavagem (Figura 1A).

3. Rubor de medula

1. Para lavar a medula dos fêmures, use uma seringa de 3 mL cheia de meio TC ou PBS com uma agulha 23G. Encha a seringa antes de expor a medula.
2. Use uma tesoura para expor a medula cortando a extremidade do fêmur em ambas as epífises.
3. Insira a ponta da agulha no fêmur e lave suavemente a medula em um prato de 10 cm.
4. Passe a agulha por todo o comprimento do fêmur e lave até que a cor do osso fique branca. Normalmente, a maior parte da medula pode ser lavada com 2-3 mL de meio.
5. Lave todos os fêmures e medula óssea no prato. Use uma agulha para quebrar quaisquer aglomerados visíveis. Coe a medula em um tubo cônico de 50 mL (Figura 1A).

4. Lise de hemácias

1. Gire a medula a 190 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante.
2. Ressuspenda o pellet em 4 ml de tampão de lise ACK com uma pipeta. Deixe o tampão de lise de hemácias funcionar por 5 min em temperatura ambiente.
3. Adicione 4 mL de meio TC RPMI-C 10% (RPMI 1640 -GlutaMAX) suplementado com 2-mercaptoetanol, gentamicina, estreptomicina e 10% FCS à suspensão medular e gire a 1300 x g por 10 min.
4. Coe novamente para remover os detritos de hemácias e ressuspenda em um pequeno volume de RPMI-C 10% para contagem.
5. Conte as células com um contador de células (Figura 1B). Um contador de células Vi foi usado para determinar a contagem e a viabilidade das células na suspensão.

5. Chapeamento e cultura

1. Adicione 10 mL de RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF (Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos, um regulador essencial da proliferação, diferenciação e sobrevivência de monócitos/macrófagos) a quantas placas de 10 cm desejar.
2. Adicione um volume apropriado de células contadas para que cada placa de 10 cm contenha 1 x 10⁶ células. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C (definida como dia 0).
3. No dia 3, adicione suavemente 5 mL de RPMI-C fresco a 10% + 10 ng/mL M-CSF a cada placa.
   NOTA: No dia 7, os BMDMs devem estar prontos para teste (Figura 1C).

6. Colheita de pratos

1. Use um microscópio óptico para confirmar que a maioria das células aderiu às placas.
2. Aspire suavemente o meio. Em seguida, adicione 3 mL de PBS e gire suavemente a placa. Aspire bem para remover quaisquer células não aderentes restantes.
3. Adicione 7-10 mL de PBS frio à placa, use uma pipeta P1000 para lavar o fundo das placas e colha todas as células restantes em um tubo de coleta.
   NOTA: Mantenha os tubos no gelo, pois os macrófagos são muito aderentes e aderem ao interior do tubo. Se as células se mantivessem frias, elas seriam menos aderentes.
4. Centrifugar, contar e células de placa para experimentos (Figura 1D). Usando citometria de fluxo, as células resultantes devem ser >95% positivas para CD11b e F4/80. (A polarização dos macrófagos foi determinada pela coloração com marcadores semelhantes a M1 de CD38, TNF-a e marcadores semelhantes a MCP-1 e M2 de CD206.
   NOTA: Execute as etapas 6.1-6.3 no gabinete de biossegurança e execute a etapa 6.4 na bancada. Mantenha as técnicas assépticas durante todo o procedimento.

Figura 1: Fluxo de trabalho gráfico da cultura de medula óssea de camundongos de macrófagos derivados de BM. (A) Colheita da perna, exposição do fêmur e rubor da medula; (b) lise de hemácias; (C) Revestimento e cultura; (D) Colheita de células das placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Um dia antes do ensaio do analisador de fluxo metabólico: semeadura e polarização das células para o teste glicolítico

1. Aqueça o Metabolic Flux Analyzer a 37 °C ligando o instrumento.
2. Hidrate um cartucho adicionando 200 μL de uma solução calibrante e incube o cartucho em uma incubadora não-CO₂ durante a noite (Figura 2A). A umidade da incubadora não-CO₂ não é importante para a hidratação do cartucho.
   1. Uma hora antes do experimento, mergulhe a placa algumas vezes para cima e para baixo, o que ajudará a remover as bolhas de ar.
3. Projete o mapa da placa no software no teste de estresse de glicólise padrão - injeção aguda, seguindo as instruções do teste.
   1. Clique no ícone do software e, em seguida, clique em Teste de injeção aguda de estresse glicólise. No ícone de definição de grupo, gere nomes de grupo.
4. Existem cinco ciclos de medição com duração de 18 minutos e quatro injeções. Altere a injeção da porta A para glicose, porta B para oligomicina, porta C para rotenona e antimicina A (Rot / AA) e porta D para 2DG.
5. Ressuspenda as células em meio RPMI-C 10% e semeie 50k células por poço, exceto as quatro bordas da placa (A1, A12, H1 e H12; Adicione apenas meios, sem células) em uma microplaca do Metabolic Flux Analyzer a um volume final de 100 μL. Normalmente, é necessário um mínimo de 40k células para realizar este ensaio.
6. Deixe as células descansarem em temperatura ambiente por 45 min para evitar o efeito de borda das células. O efeito de borda é quando o meio ao redor do perímetro da placa evapora parcialmente, o que causa mudanças de volume e concentração e reduz a viabilidade celular.
7. Adicione 10 ng/mL de LPS para polarizar os macrófagos virgens em direção a células semelhantes a M1 e adicione 20 ng/ml de IL-4 para polarizá-los em direção a células semelhantes a M2. Use pelo menos 3 a 6 poços por condição (Figura 2B).
8. Verificar as células ao microscópio e colocar a placa numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 horas.

Figura 2: Demonstração gráfica da semeadura e polarização das células. (A) Configuração do analisador de fluxo extracelular e hidratação do cartucho; (B) Polarização das células e incubação durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Dia do ensaio: XF Preparação de meio e composto

1. Complemente 100 mL de meio de ensaio XF RPMI (pH 7,4) com 2 mM de glutamina.
2. Filtre e esterilize a mídia usando um sistema de filtro a vácuo de 0,2 μm.
3. Coloque o meio de ensaio em banho-maria a 37^°C por 20 min.
4. Remover as células plaqueadas da incubadora de CO₂ a 37 °C, 5%. Lave as células com meio de ensaio duas vezes e substitua o meio anterior por meio de ensaio até o volume final de 180 μL.
5. Use um microscópio para certificar-se de que todos os poços tenham células confluentes e marque todos os poços que tenham arranhões de pipetagem. Se houver algum arranhão, remova essa placa antes de analisar.
6. Posicione a placa contendo células em uma incubadora sem CO₂ por 45 min (Figura 3A).
7. Usando os compostos e os meios de ensaio para fazer soluções de estoque de glicose (100 mM), oligomicina (100 μM), rot / AA (50 μM) e 2DG (500 mM) (Tabela 1).
8. Faça uma mistura de injeção de 10x de cada composto usando meio de ensaio (Tabela 2).

Estoques de injeção (fornecidos nos kits)	Adicionar meio de ensaio completo (mL)	Concentração de estoque final (μM)
Glicose	3	100 mil
Oligomicina	0.72	100
2-DG	3	100 mil

Tabela 1. Estoques de injeção

Portas no cartucho	Soluções de estoque	Adicionar volume de estoque	Adicionar meio de ensaio	Concentração final de injeções (10x)	Adicione este volume à porta designada (μL)	Concentração final após a injeção em cada poço
Um	Glicose (100 mM)	3000 μL + 0 μL		100 mM	20	10 mM
B	Oligomicina (100 μM)	300 μL + 2700 μL		10 μM	22	1,0 μM
C	Rotenona/Antimicina A (50 μM)	300 μL + 2700 μL		5 μM	25	0,5 μM
D	2-DG (500 mM)	300 μL + 0 μL		500 mM	28	50 mM

Tabela 2. Concentrações finais de injeção

9. Dia do ensaio: Executando o teste glicolítico agudo em macrófagos polarizados

1. Abra o modelo salvo de ensaio de estresse de glicólise (injeção aguda) no software. O teste de glicoestresse agudo padrão tem 3 minutos de mistura e medição antes de cada injeção.
2. Verifique o modelo e os detalhes do ensaio e, quando estiver pronto, clique em Executar e siga as instruções do ensaio padrão. No entanto, todos os parâmetros podem ser personalizados.
3. Remova o cartucho do sensor da incubadora não-CO₂ , remova a tampa e insira no instrumento de forma que o poço A1 da placa do cartucho caia no canto superior esquerdo do painel de inserção da máquina. Normalmente, a calibração leva entre 20 a 45 min.
4. Após terminar a calibração, o dispositivo ejetará a placa contendo a solução calibrante e segurará o cartucho do sensor. Remova o calibrante que contém a placa.
5. Remova a placa celular da incubadora não-CO₂ , remova a tampa da placa e insira-a na máquina. Clique em Executar (Figura 3B).
6. Quando o ensaio for concluído, a máquina ejetará a placa da célula e o cartucho do sensor.
7. Remova a mídia da placa e congele-a a -20 °C para posterior normalização.
8. Use o kit de ensaio de proliferação celular comercial (por exemplo, CyQUANT) para normalizar as células.
9. Adicione 1 mL de Composto B ou tampão de lise a 19 mL de água destilada livre de nuclease.
10. Adicione 100 μL de solução de trabalho Composto A ou GR à solução acima mencionada.
11. Certifique-se de que as células da placa estejam descongeladas e, em seguida, adicione 200 μL da solução a cada poço.
12. Incube por 5 min em temperatura ambiente (RT).
13. Meça a fluorescência em comprimentos de onda de excitação de 480 nm e emissão de 520 nm usando um leitor de placas.
14. Normalize as células no painel de normalização do software.
15. Normalize as células com base na contagem de células de macrófagos ingênuos ( Figura 3C ). Considere a média dos macrófagos ingênuos como 1 (dividindo o número de células de cada poço pelo número médio de células de macrófagos ingênuos) e aplique-os a todos os macrófagos.

Figura 3: Dia do ensaio: preparação do meio e do composto e execução do ensaio. (A) Preparação das células para o ensaio; (B) Preparação, calibração e execução do ensaio de compostos; (C) Normalização e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A glicólise e a fosforilação oxidativa mitocondrial são as duas principais vias de produção de ATP nas células (Figura 4A). Algumas células têm a capacidade de alternar entre esses dois caminhos para atender às suas demandas de energia. A conversão de glicose em piruvato no citoplasma é chamada de glicólise. O piruvato tem dois destinos; ele será convertido em lactato ou metabolizado através do ciclo de TCA e, ...

Discussão

Como mencionado anteriormente, a máquina analisadora de fluxo extracelular pode fornecer informações em tempo real sobre duas principais vias de produção de energia das células, medindo o OCR (taxa de consumo de oxigênio), um indicador da atividade mitocondrial do OXPHOS, e o ECAR (taxa de acidificação extracelular), que é um indicador de glicólise. Os macrófagos podem usar ambas as vias, dependendo de seu microambiente. Eles também podem mudar suas vias de produção de ene...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100