Kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik karakterizasyonu için kapsamlı bir yüksek verimli protokol

Özet

Bu protokol, canlı kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMDM'ler) izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik metabolik durumunun ölçümü için ayrıntılı ve kapsamlı yöntemler sağlar. Bu makale, BMDM'lerin gerçek zamanlı olarak iş akışı ve glikolitik değerlendirmesi için gerçekçi görsel çizimlerle adım adım talimatlar sağlar.

Özet

Makrofajlar en önemli antijen sunan hücreler arasındadır. Makrofajların birçok alt kümesi, benzersiz metabolik imzalarla tanımlanmıştır. Makrofajlar genellikle M1 benzeri (inflamatuar) ve M2 benzeri (antienflamatuar) alt tipler olarak sınıflandırılır. M1 benzeri makrofajlar, LPS ve / veya INF-γ, IL-12 ve IL-2 gibi pro-inflamatuar sitokinler tarafından aktive edilen pro-inflamatuar makrofajlardır. M1 benzeri polarize makrofajlar, konağın çeşitli bakteri ve virüslere karşı savunmasına aracılık ederek çeşitli hastalıklarda rol oynar. Bu, LPS'nin neden olduğu M1 benzeri makrofajları ve enflamatuar hastalıklardaki metabolik durumlarını incelemek için çok önemlidir. M2 benzeri makrofajlar, anti-inflamatuar sitokinler ve stimülatörler tarafından aktive edilen anti-inflamatuar makrofajlar olarak kabul edilir. Pro-inflamatuar durum altında, makrofajlar glikolitik fonksiyonda artmış glikoliz gösterir. Glikolitik fonksiyon, hücre dışı akı (XF) analizörleri kullanılarak glikoliz, glikolitik kapasite, glikolitik rezerv, telafi edici glikoliz veya glikolitik olmayan asitleştirme bağlamında aktif olarak araştırılmıştır.

Bu makale, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (BMDM'ler) solunum yaparken, tüketirken ve enerji üretirken glikolitik durumların takip etmesi kolay adımlarla gerçek zamanlı olarak nasıl değerlendirileceğini göstermektedir. Bu protokolde spesifik glikoliz inhibitörleri ve aktivatörleri kullanarak, hücrelerdeki glikolitik metabolik süreçlerin sistemik ve eksiksiz bir görünümünün nasıl elde edileceğini ve daha doğru ve gerçekçi sonuçların nasıl sağlanacağını gösteriyoruz. Birden fazla glikolitik fenotipi ölçebilmek için, BMDM'lerin polarizasyon değerlendirmesi için kolay, hassas, DNA tabanlı bir normalizasyon yöntemi sunuyoruz. BMDM'lerin fenotipinin ve metabolik durumunun kültürlenmesi, aktivasyonu / polarizasyonu ve tanımlanması, birçok farklı hastalık türünün araştırılmasına yardımcı olabilecek çok önemli tekniklerdir.

Bu yazıda, saf M0 makrofajlarını sırasıyla LPS ve IL4 ile M1 benzeri ve M2 benzeri makrofajlara polarize ettik ve hücre dışı akı analizi ve glikolitik aktivatörler ve inhibitörler kullanarak BMDM'lerde gerçek zamanlı ve zaman içinde uzunlamasına kapsamlı bir glikolitik parametre seti ölçtük.

Giriş

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık sistemi M1'in en kritik hücrelerinden biridir. Bulaşıcı hastalıkların, fagositozun, antijen sunumunun ve inflamasyonun düzenlenmesinde rol oynarlar². Ayrıca, makrofajların salgıladıkları çeşitli sitokinler aracılığıyla diğer bağışıklık hücrelerini düzenlemeleri gerekir³. Makrofaj fenotiplerinde büyük bir spektrum vardır⁴. Makrofajların maruz kaldığı sinyallere bağlı olarak, farklı enflamatuar ve metabolik durumlara doğru polarize olurlar⁵. Makrofajlar, makrofajların hangi dokuda bulunduğuna bağlı olarak çeşitli hastalıklarda metabolik değişiklikler gösterir⁶. Polarize makrofajlar, glikolitik metabolizmalarını, lipid metabolizmalarını, amino asit metabolizmalarını ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyonlarını (OXPHOS) yeniden programlama veya değiştirme yeteneğine ^sahiptir7,8. Klasik olarak aktive edilmiş M1 benzeri makrofajlar ve alternatif olarak aktive edilmiş M2 benzeri makrofajlar, makrofajların en çok çalışılan iki fenotipidir³. Aktive edilmemiş hareketsiz makrofajlar M0 makrofajları olarak adlandırılır. M0 makrofajlarının M1 benzeri bir fenotipe doğru polarizasyonu, naif BMDM'lerin bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmasıyla ^{indüklenebilir9}. PI3K-AKT-mTOR-HIF1a sinyal yolu, enflamatuar sitokinler, interferon-gama (IFN γ,) veya tümör nekroz faktörü (TNF)¹⁰ varlığında makrofajlarda aktive edilebilir. M1 benzeri makrofajlar, glikoliz metabolizması seviyelerinde artışa, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) seviyelerinde azalmaya, bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklarda rol oynayan inflamatuar sitokinler üretmeye^{sahiptir 8}. Öte yandan, M2 benzeri fenotipe doğru polarizasyon, İnterlökin (IL)-4, JAK-STAT, PPAR ve AMPK yolları yoluyla veya (IL)-13 ve TGFβ yolları^11,12 ile indüklenebilir.

M1 benzeri makrofajların aksine, M2 benzeri makrofajlar glikolizi azaltmış ve OXPHOS'u arttırmıştır ve anti-parazitik ve doku onarım aktivitelerinde rol oynarlar ^8,13. BMDM'ler, kemik iliği kök hücrelerinden türetilen makrofajların incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Glikoliz ve OXPHOS, hücrelerde önde gelen iki enerji üretim yoludur¹⁴. Mikro çevrelerine bağlı olarak, BMDM'ler bu yollardan herhangi birini kullanmayı seçebilir; Bazı durumlarda, birinden diğerine geçin veya her iki yolu^{da kullanın 14}. Bu çalışmada aktive olmuş proinflamatuar makrofajlarda glikoliz metabolizması üzerine odaklandık. Sitoplazmadaki glikoz piruvata ve daha sonra laktata dönüştürüldüğünde, hücreler ortamda, M1 benzeri hücrelerin⁵ çevrili ortamında asitleşme oranında bir yükselmeye neden olan protonlar üretir. Hücre ortamının asitleşme hızını ölçmek için bir hücre dışı akı analizörü kullanıldı. Sonuçlar Hücre Dışı Asitleşme Hızı (ECAR) veya Proton Akış Hızı olarak rapor edilir.

Polarize makrofajlarda glikoliz seviyelerine erişmek için optimize edilmiş, hızlı ve kolay bir yöntem, glikolitik fenotipi, metabolit değişikliklerini ve inhibitörlerin/aktivatörlerin ve ilaçların polarize makrofajlar üzerindeki etkilerini belirlemek için gereklidir. Bu yazıda açıklanan yöntem, spesifik glikoliz faktörleri (Glikoliz, Glikolitik kapasite, Glikolitik rezerv ve glikolitik olmayan asitleşme) ve ayrıca glikolitik metabolizmanın metabolik yeniden programlanması hakkında bilgi vermek için optimize edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan inhibitör (2DG) açıkça glikoliz yolunu hedefler.

Bu optimize edilmiş protokol, yayınlanmış bir protokol¹⁶, üreticinin kullanıcı kılavuzlarının glikolitik tahlillerinin hücre dışı akı analizi ve üreticinin Ar-Ge bilim adamları ile doğrudan iletişimin kombinasyonuna dayalı olarak değiştirilmiş ve geliştirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Fareler, Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu (AAALAC) ve Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneği (AALAS) yönergelerine göre ve Texas A&M Üniversitesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak insancıl bir şekilde sakrifiye edildi.

1. Fareler, kemik iliği hasadı ve BMDM kültürü

1. Fareyi kurban edin (6-10 haftalık C57Bl / 6 fareler bu protokoldeydi) ve ventral tarafına yatırın, cildi ve periton tabakasını kesin ve bacaklarını nazikçe soyun.
   NOT: Fareyi ötenazi yapmak için CO₂ gazına maruz kalma kullanın.
2. Her iki arka bacağınızı kalçadan aşağıya doğru ayırın, kemiği kesmemeye dikkat edin.
3. Tüm bacağınızı 50 mL'lik boş bir konik tüpe yerleştirin (daha sonra çıkarmak için kolay bir tutuş sağlamak için ayaklar yukarı bakacak şekilde) ve her iki bacağınızı da fareden almaya devam edin.

2. Femur maruziyeti

NOT: Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. Her bacaktan kaval kemiğini keserek uyluk kemiğini kesin ve uyluk kemiğini çevreleyen dokuyu makas ve laboratuvar kağıdı ile mümkün olduğunca fazla dokuyla çıkarın.
2. HaŞedilmiş, "temizlenmiş" uyluk kemiğini, doku kültürü (TC) ortamı veya PBS ile doyurulmuş bir laboratuvar kağıdı parçası içeren 10 cm'lik bir plakaya yerleştirin. Onları buzun üzerine yerleştirin.
3. Yıkama aşamasına geçmeden önce femurları toplamaya ve tüm femurlardan doku çıkarmaya devam edin (Şekil 1A).

3. İlik yıkama

1. Femurlardan iliği temizlemek için, TC besiyeri ile doldurulmuş 3 mL'lik bir şırınga veya 23G iğneli PBS kullanın. İliği açığa çıkarmadan önce şırıngayı doldurun.
2. Femurun en ucunu her iki epifizde keserek iliği ortaya çıkarmak için makas kullanın.
3. İğne ucunu uyluk kemiğine sokun ve iliği nazikçe 10 cm'lik bir tabağa boşaltın.
4. İğneyi uyluk kemiğinin tüm uzunluğu boyunca gezdirin ve kemik rengi beyaza dönene kadar yıkayın. Genellikle, çoğu ilik 2-3 mL besiyeri ile yıkanabilir.
5. Tüm uyluk kemiklerini yıkayın ve kemik iliğini tabakta toplayın. Görünür kümeleri kırmak için bir iğne kullanın. İliği 50 mL'lik konik bir tüpe süzün (Şekil 1A).

4. RBC lizisi

1. İliği 10 dakika boyunca 190 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
2. Peletleri bir pipet ile 4 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin. RBC lizis tamponunun oda sıcaklığında 5 dakika çalışmasına izin verin.
3. İlik süspansiyonuna 2-merkaptoetanol, gentamisin, streptomisin ve %10 FCS ile desteklenmiş 4 mL TC orta RPMI-C %10 (RPMI 1640 -GlutaMAX) ekleyin ve 10 dakika boyunca 1300 x g'da döndürün.
4. RBC kalıntılarını çıkarmak için tekrar süzün ve saymak için %10'luk küçük bir RPMI-C hacminde yeniden askıya alın.
5. Hücreleri bir hücre sayacı ile sayın (Şekil 1B). Süspansiyondaki hücrelerin sayısını ve canlılığını belirlemek için bir Vi-Hücre Sayacı kullanıldı.

5. Kaplama ve kültür

1. 10 mL RPMI-C %10 + 10 ng/mL M-CSF (Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör, monosit/makrofaj proliferasyonu, farklılaşması ve sağkalımının temel düzenleyicisi) istediğiniz kadar 10 cm'lik plakaya ekleyin.
2. Her 10 cm'lik plaka 1 x 10⁶ hücre içerecek şekilde uygun hacimde sayılan hücre ekleyin. Plakaları 37 °C'lik bir inkübatöre koyun (0. gün olarak tanımlanır).
3. 3. günde, her bir tabağa yavaşça 5 mL taze RPMI-C %10 + 10 ng/mL M-CSF ekleyin.
   NOT: 7. günde, BMDM'ler test için hazır olmalıdır (Şekil 1C).

6. Plakalardan hasat

1. Çoğu hücrenin plakalara yapıştığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın.
2. Ortamı nazikçe aspire edin. Ardından 3 mL PBS ekleyin ve plakayı hafifçe döndürün. Kalan yapışmayan hücreleri çıkarmak için bunu iyice aspire edin.
3. Plakaya 7-10 mL soğuk PBS ekleyin, plakaların altını yıkamak için bir P1000 pipeti kullanın ve kalan tüm hücreleri bir toplama tüpüne toplayın.
   NOT: Makrofajlar çok sıkı bir şekilde yapıştığından ve tüpün içine yapışacağından tüpleri buz üzerinde tutun. Hücreler soğuk tutulursa, daha az sıkı bir şekilde yapışırlar.
4. Deneyler için santrifüj, sayım ve plaka hücreleri (Şekil 1D). Flow sitometrisi kullanılarak, elde edilen hücreler CD11b ve F4/80 için %>95 pozitif olmalıdır. (makrofaj polarizasyonu, CD38, TNF-a'nın M1 benzeri belirteçleri ve CD206'nın MCP-1 ve M2 benzeri belirteçleri ile boyanarak belirlendi.
   NOT: Biyogüvenlik kabininde 6.1-6.3 adımlarını ve tezgah üzerinde 6.4 adımını gerçekleştirin. Prosedür boyunca aseptik teknikleri koruyun.

Şekil 1: BM'den Türetilmiş Makrofajların fare kemik iliği kültürünün grafiksel iş akışı. (A) Bacak hasadı, Femur maruziyeti ve ilik yıkaması; (b) RBC Lizisi; (C) Kaplama ve kültür; (D) Plakalardan hücre hasadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Metabolik akı analizörü testinden bir gün önce: glikolitik test için hücrelerin tohumlanması ve polarizasyonu

1. Cihazı açarak Metabolik Akı Analizörünü 37 °C'ye ısıtın.
2. 200 μL'lik bir Kalibrant Çözeltisi ekleyerek bir kartuşu nemlendirin ve kartuşu gece boyunca CO₂ olmayan bir inkübatörde inkübe edin (Şekil 2A). CO₂ olmayan inkübatörün nemi, kartuş hidrasyonu için önemli değildir.
   1. Deneyden bir saat önce, plakayı birkaç kez yukarı ve aşağı batırın, bu da hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olacaktır.
3. Testin talimatını takip ederek, varsayılan glikoliz stres testi-akut enjeksiyonda yazılım üzerindeki plaka haritasını tasarlayın.
   1. Yazılım simgesine tıklayın ve ardından Glikoliz stres-akut enjeksiyon testine tıklayın. Grup tanımı simgesinde, grup adları oluşturun.
4. 18 dakikalık bir süre ve dört enjeksiyon ile beş ölçüm döngüsü vardır. Port A'nın enjeksiyonunu Glikoz'a, port B'yi Oligomisin'e, Port C'yi Rotenone ve antimisin A'ya (Rot / AA) ve Port D'yi 2DG'ye değiştirin.
5. Hücreleri RPMI-C% 10 ortamında yeniden askıya alın ve plakanın dört kenarı (A1, A12, H1 ve H12; Yalnızca ortam ekleyin, hücre yok) bir Metabolik Akı Analizörü mikroplakasında 100 μL'lik bir nihai hacme kadar Normalde bu testi yapmak için en az 40 bin hücre gerekir.
6. Hücrelerin kenar etkisini önlemek için hücrelerin oda sıcaklığında 45 dakika oturmasına izin verin. Kenar etkisi, plakanın çevresinden gelen ortamın kısmen buharlaşmasıdır, bu da hacim ve konsantrasyon değişikliklerine neden olur ve hücre canlılığını azaltır.
7. Naif makrofajları M1 benzeri hücrelere doğru polarize etmek için 10 ng / mL LPS ekleyin ve onları M2 benzeri hücrelere doğru polarize etmek için 20 ng / ml IL-4 ekleyin. Koşul başına en az 3 ila 6 kuyu kullanın (Şekil 2B).
8. Hücreleri mikroskop altında kontrol edin ve plakayı 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirin.

Şekil 2: Hücrelerin tohumlanması ve polarizasyonunun grafiksel gösterimi. (A) Hücre dışı akı analizörü kurulumu ve kartuş hidrasyonu; (B) Hücrelerin polarizasyonu ve gece boyunca inkübasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

8. Tahlil günü: XF Orta ve bileşik hazırlama

1. 100 mL XF RPMI (pH 7.4) test ortamını 2 mM glutamin ile tamamlayın.
2. 0,2 μm vakumlu filtre sistemi kullanarak ortamı filtreyle sterilize edin.
3. Tahlil ortamını 20 dakika boyunca 37 ^° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
4. Kaplanmış hücreleri 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörden çıkarın. Hücreleri tahlil ortamı ile iki kez yıkayın ve önceki ortamı 180 μL'lik son hacme kadar tahlil ortamı ile değiştirin.
5. Tüm kuyucukların birleşen hücrelere sahip olduğundan emin olmak için bir mikroskop kullanın ve pipetlemeden kaynaklanan herhangi bir çizik olan kuyucukları işaretleyin. Herhangi bir çizik varsa, analiz etmeden önce o plakayı çıkarın.
6. Hücre içeren plakayı CO_{olmayan bir 2} inkübatöre 45 dakika boyunca yerleştirin (Şekil 3A).
7. Glikoz (100 mM), Oligomisin (100 μM), Rot / AA (50 μM) ve 2DG (500 mM) stok çözeltileri yapmak için bileşiklerin ve tahlil ortamının kullanılması (Tablo 1).
8. Tahlil ortamı kullanarak her bileşiğin 10x enjeksiyon karışımını yapın (Tablo 2).

Enjeksiyon Stokları (Kitlerde bulunur)	Komple tahlil ortamı ekleyin (mL)	Nihai Stok konsantrasyonu (μM)
Glikoz	3	100 bin
Oligomisin	0.72	100
2-DG	3	100 bin

Tablo 1. Enjeksiyon stokları

Kartuş üzerindeki bağlantı noktaları	Stok çözümleri	Stok hacmi ekle	Tahlil ortamı ekleyin	Enjeksiyonların son konsantrasyonu (10x)	Bu hacmi belirlenen bağlantı noktasına (μL) ekleyin	Her kuyucuğa enjeksiyondan sonra son konsantrasyon
A	Glikoz (100 mM)	3000 μL + 0 μL		100 milyon	20	10 milyon
B	Oligomisin (100 μM)	300 μL + 2700 μL		10 μM	22	1,0 μM
C	Rotenon / Antimisin A (50 μM)	300 μL + 2700 μL		5 μM	25	0,5 μM
D	2-DG (500 mM)	300 μL + 0 μL		500 milyon	28	50 milyon

Tablo 2. Son Enjeksiyon Konsantrasyonları

9. Test günü: Polarize makrofajlar üzerinde akut glikolitik testin yapılması

1. Kaydedilen Glikoliz stres testi (Akut enjeksiyon) şablonunu yazılımdan açın. Varsayılan Akut Gliko-Stres Testi, her enjeksiyondan önce 3 dakikalık karışım ve ölçüme sahiptir.
2. Şablonu ve tahlil ayrıntılarını kontrol edin ve hazır olduğunuzda Çalıştır'a tıklayın ve varsayılan tahlilin talimatını izleyin. Ancak, tüm parametreler özelleştirilebilir.
3. Sensör Kartuşunu CO₂ olmayan inkübatörden çıkarın, kapağı çıkarın ve kartuş plakasının A1 kuyusu makinenin yerleştirme panelinin sol üst köşesine düşecek şekilde alete yerleştirin. Genellikle kalibrasyon 20 ila 45 dakika sürer.
4. Kalibrasyonu bitirdikten sonra, cihaz kalibant solüsyonunu içeren plakayı çıkaracak ve sensör kartuşunu tutacaktır. Plakayı içeren kalibrantı çıkarın.
5. Hücre plakasını CO₂ olmayan inkübatörden çıkarın, plaka kapağını çıkarın ve makineye yerleştirin. Çalıştır'a tıklayın (Şekil 3B).
6. Test tamamlandığında, makine hücre plakasını ve sensör kartuşunu çıkaracaktır.
7. Ortamı plakadan çıkarın ve daha fazla normalleştirme için -20 °C'de dondurun.
8. Hücreleri normalleştirmek için ticari hücre proliferasyon test kitini (örneğin, CyQUANT) kullanın.
9. 19 mL nükleaz içermeyen damıtılmış suya 1 mL Bileşik B veya lizis tamponu ekleyin.
10. Yukarıda belirtilen çözeltiye 100 μL Bileşik A veya GR çalışma çözeltisi ekleyin.
11. Plakadaki hücrelerin çözüldüğünden emin olun ve ardından her bir oyuğa 200 μL çözelti ekleyin.
12. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
13. Bir plaka okuyucu kullanarak floresansı 480 nm uyarma ve 520 nm emisyon dalga boylarında ölçün.
14. Yazılımın normalleştirme panelindeki hücreleri normalleştirin.
15. Naif makrofaj hücre sayısına dayalı hücreleri normalleştirin (Şekil 3C). Naif makrofajların ortalamasını 1 olarak düşünün (her bir oyuğun hücre sayısını naif makrofajların ortalama hücre sayısına bölerek) ve bunları tüm makrofajlara uygulayın.

Şekil 3: Tahlil günü: besiyeri ve bileşik hazırlama ve tahlilin çalıştırılması. (A) Test için hücre hazırlığı; (B) Bileşiklerin hazırlanması, kalibrasyonu ve tahlilin çalıştırılması; (C) Normalleştirme ve veri analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Glikoliz ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon, hücrelerdeki iki ana ATP üretim yoludur (Şekil 4A). Bazı hücreler, enerji taleplerini karşılamak için bu iki yol arasında geçiş yapma yeteneğine sahiptir. Glikozun sitoplazmada piruvata dönüştürülmesine glikoliz denir. Pirüvatın iki kaderi vardır; ya laktata dönüştürülecek ya da TCA döngüsü boyunca ve sonunda daha fazla ATP üretmek için elektron ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Daha önce de belirtildiği gibi, hücre dışı akı analizörü makinesi, mitokondriyal OXPHOS aktivitesinin bir göstergesi olan OCR'yi (oksijen tüketim oranı) ve glikolizin bir göstergesi olan ECAR'ı (hücre dışı asitleşme hızı) ölçerek hücrelerin iki ana enerji üreten yolu hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlayabilir. Makrofajlar, mikro çevrelerine bağlı olarak her iki yolu da kullanabilirler. Ayrıca enerji üretim yollarını da değiştirebilirler

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100