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Method Article
Dieses Protokoll bietet detaillierte und umfassende Methoden für die Isolierung, Kultur, Polarisation und Messung des glykolytischen Stoffwechselzustands von lebenden Makrophagen (BMDMs) aus dem Knochenmark. Dieses Dokument bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen mit realistischen visuellen Illustrationen für den Arbeitsablauf und die glykolytische Bewertung von BMDMs in Echtzeit.
Makrophagen gehören zu den wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen. Viele Untergruppen von Makrophagen wurden mit einzigartigen metabolischen Signaturen identifiziert. Makrophagen werden allgemein in M1-ähnliche (entzündliche) und M2-ähnliche (entzündungshemmende) Subtypen eingeteilt. M1-ähnliche Makrophagen sind proinflammatorische Makrophagen, die durch LPS und/oder entzündungsfördernde Zytokine wie INF-γ, IL-12 und IL-2 aktiviert werden. M1-ähnliche polarisierte Makrophagen sind an verschiedenen Krankheiten beteiligt, indem sie die Abwehr des Wirts an eine Vielzahl von Bakterien und Viren vermitteln. Dies ist sehr wichtig, um LPS-induzierte M1-ähnliche Makrophagen und ihre Stoffwechselzustände bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen. M2-ähnliche Makrophagen gelten als entzündungshemmende Makrophagen, die durch entzündungshemmende Zytokine und Stimulatoren aktiviert werden. Im proinflammatorischen Zustand zeigen Makrophagen eine erhöhte Glykolyse in der glykolytischen Funktion. Die glykolytische Funktion wurde aktiv im Zusammenhang mit der Glykolyse, der glykolytischen Kapazität, der glykolytischen Reserve, der kompensatorischen Glykolyse oder der nicht-glykolytischen Ansäuerung mit extrazellulären Flussanalysatoren (XF) untersucht.
In diesem Artikel wird gezeigt, wie die glykolytischen Zustände in Echtzeit mit leicht verständlichen Schritten bewertet werden können, wenn die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) atmen, verbrauchen und Energie produzieren. Anhand spezifischer Inhibitoren und Aktivatoren der Glykolyse zeigen wir in diesem Protokoll, wie man einen systemischen und vollständigen Überblick über die glykolytischen Stoffwechselprozesse in den Zellen erhält und genauere und realistischere Ergebnisse liefert. Um mehrere glykolytische Phänotypen messen zu können, bieten wir eine einfache, sensitive, DNA-basierte Normalisierungsmethode zur Polarisationsbestimmung von BMDMs an. Die Kultivierung, Aktivierung/Polarisation und Identifizierung des Phänotyps und des Stoffwechselzustands der BMDMs sind entscheidende Techniken, die bei der Untersuchung vieler verschiedener Arten von Krankheiten helfen können.
In dieser Arbeit polarisierten wir die naiven M0-Makrophagen zu M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Makrophagen mit LPS bzw. IL4 und maßen einen umfassenden Satz glykolytischer Parameter in BMDMs in Echtzeit und longitudinal über die Zeit, wobei wir extrazelluläre Flussanalysen und glykolytische Aktivatoren und Inhibitoren verwendeten.
Makrophagen sind eine der kritischsten Zellen des M1-ähnlichen angeborenen Immunsystems. Sie sind an der Beseitigung von Infektionskrankheiten, Phagozytose, Antigenpräsentation und Entzündungsregulation beteiligt2. Darüber hinaus sind Makrophagen erforderlich, um andere Immunzellen über verschiedene Zytokine, die sie freisetzen, zu regulieren3. Es gibt ein großes Spektrum an Makrophagen-Phänotypen4. Abhängig von den Signalen, denen Makrophagen ausgesetzt sind, polarisieren sie in Richtung unterschiedlicher Entzündungs- und Stoffwechselzustände5. Makrophagen manifestieren metabolische Veränderungen bei verschiedenen Krankheiten, je nachdem, in welchem Gewebe sich die Makrophagen befinden6. Polarisierte Makrophagen haben die Fähigkeit, ihren glykolytischen Stoffwechsel, ihren Lipidstoffwechsel, ihren Aminosäurestoffwechsel und ihre mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) umzuprogrammieren oder umzuschalten7,8. Klassisch aktivierte M1-ähnliche Makrophagen und alternativ aktivierte M2-ähnliche Makrophagen sind die beiden am besten untersuchten Phänotypen von Makrophagen3. Nicht aktivierte ruhende Makrophagen werden als M0-Makrophagen bezeichnet. Die Polarisation von M0-Makrophagen in Richtung eines M1-ähnlichen Phänotyps kann durch Stimulation naiver BMDMs mit bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) induziert werden9. Der PI3K-AKT-mTOR-HIF1a-Signalweg kann in Makrophagen in Gegenwart von inflammatorischen Zytokinen, Interferon-gamma (IFN γ,) oder Tumornekrosefaktor (TNF)10 aktiviert werden. M1-ähnliche Makrophagen haben einen erhöhten Glykolysestoffwechsel, eine verringerte oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) und produzieren entzündliche Zytokine, die an Infektions- und Entzündungskrankheiten beteiligt sind8. Andererseits kann die Polarisation in Richtung des M2-ähnlichen Phänotyps durch Interleukin (IL)-4, über die JAK-STAT-, PPAR- und AMPK-Signalwege oder durch (IL)-13 und TGFβ-Signalwege induziert werden11,12.
Im Gegensatz zu M1-ähnlichen Makrophagen haben M2-ähnliche Makrophagen eine verminderte Glykolyse und ein erhöhtes OXPHOS und sind an antiparasitären und gewebereparierenden Aktivitäten beteiligt 8,13. BMDMs sind ein weit verbreitetes System zur Untersuchung von Makrophagen, die aus Knochenmarkstammzellen gewonnen werden. Glykolyse und OXPHOS sind die beiden führenden Energieproduktionswege in den Zellen14. Basierend auf ihrer Mikroumgebung können BMDMs sich für einen dieser Wege entscheiden. Wechseln Sie in einigen Fällen von einem zum anderen oder verwenden Sie beide Wege14. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf den Glykolysestoffwechsel in aktivierten proinflammatorischen Makrophagen. Wenn die Glukose im Zytoplasma in Pyruvat umgewandelt wird und dann Laktat wird, produzieren die Zellen Protonen im Medium, die eine Erhöhung der Versauerungsrate im umgebenden Medium von M1-ähnlichen Zellen verursachen5. Ein extrazellulärer Flussanalysator wurde verwendet, um die Versauerungsrate der Zellmedien zu messen. Die Ergebnisse werden als extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) oder als Protonenausflussrate angegeben.
Eine optimierte, schnelle und einfache Methode zum Zugriff auf die Glykolyseniveaus in polarisierten Makrophagen ist unerlässlich, um den glykolytischen Phänotyp, Metabolitenveränderungen und die Auswirkungen von Inhibitoren/Aktivatoren und Medikamenten auf die polarisierten Makrophagen zu bestimmen. Die in diesem Manuskript beschriebene Methode wurde optimiert, um Informationen über spezifische Glykolysefaktoren (Glykolyse, glykolytische Kapazität, glykolytische Reserve und nicht-glykolytische Ansäuerung) sowie über die metabolische Reprogrammierung des glykolytischen Stoffwechsels zu erhalten. Der in dieser Studie verwendete Inhibitor (2DG) zielt explizit auf den Glykolyseweg ab.
Dieses optimierte Protokoll wurde auf der Grundlage der Kombination eines veröffentlichten Protokolls16, der extrazellulären Flussanalyse von glykolytischen Assays in den Benutzerhandbüchern des Herstellers und der direkten Kommunikation mit den Forschungs- und Entwicklungswissenschaftlern des Herstellers modifiziert und verbessert.
Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) und der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) und unter Verwendung von Protokollen, die vom Texas A&M University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden, auf humane Weise getötet.
1. Knochenmarkentnahme von Mäusen und Kultivierung von BMDMs
2. Freilegung des Oberschenkelknochens
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.
3. Mark-Spülung
4. Erythrozyten-Lyse
5. Anrichten und Kultur
6. Ernte von Tellern
Abbildung 1: Grafischer Arbeitsablauf der Knochenmarkkultur von Mäusen mit BM-abgeleiteten Makrophagen. (A) Beinentnahme, Femur-Exposition und Knochenmarkspülung; (b) Erythrozyten-Lyse; (C) Beschichtung und Kultur; (D) Zellernte aus den Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
7. Am Tag vor dem Metabolic Flux Analyzer Assay: Aussaat und Polarisation der Zellen für den glykolytischen Test
Abbildung 2: Grafische Demonstration der Aussaat und Polarisation der Zellen. (A) Einrichtung des extrazellulären Flussanalysators und Kartuschenhydratation; (B) Polarisation der Zellen und Inkubation über Nacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
8. Tag des Assays: Herstellung von XF Medium und Verbindung
Injektionsschäfte (in den Kits enthalten) | Vollständiges Assay-Medium (ml) hinzufügen | Endkonzentration des Stammes (μM) |
Traubenzucker | 3 | 100 Tsd. |
Oligomycin | 0.72 | 100 |
2-GD | 3 | 100 Tsd. |
Tabelle 1. Injektions-Bestände
Anschlüsse an der Patrone | Lagerlösungen | Hinzufügen des Lagervolumens | Hinzufügen von Assay-Medien | Endkonzentration der Injektionen (10x) | Fügen Sie dieses Volumen zum angegebenen Port hinzu (μL) | Endkonzentration nach der Injektion in jeder Vertiefung |
Ein | Glukose (100 mM) | 3000 μL + 0 μL | ca. 100 mM | 20 | ca. 10 mM | |
B | Oligomycin (100 μM) | 300 μL + 2700 μL | 10 μM | 22 | 1,0 μM | |
C | Rotenon/ Antimycin A (50 μM) | 300 μL + 2700 μL | 5 μM | 25 | 0,5 μM | |
D | 2-DG (500 mM) | 300 μL + 0 μL | 500 mM | 28 | 50 mM |
Tabelle 2. Konzentrationen der abschließenden Injektion
9. Tag des Assays: Durchführung des akuten glykolytischen Tests an polarisierten Makrophagen
Abbildung 3: Tag des Assays: Vorbereitung des Mediums und der Verbindungen und Durchführung des Assays. (A) Vorbereitung der Zellen für den Assay; (B) Vorbereitung, Kalibrierung und Durchführung des Assays; (C) Normalisierung und Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Glykolyse und mitochondriale oxidative Phosphorylierung sind die beiden wichtigsten ATP-Produktionswege in den Zellen (Abbildung 4A). Einige Zellen haben die Fähigkeit, zwischen diesen beiden Wegen zu wechseln, um ihren Energiebedarf zu decken. Die Umwandlung von Glukose in Pyruvat im Zytoplasma wird als Glykolyse bezeichnet. Pyruvat hat zwei Schicksale; Es wird entweder in Laktat umgewandelt oder durch den TCA-Zyklus und sc...
Wie bereits erwähnt, kann das extrazelluläre Flussanalysator Echtzeitinformationen über zwei wichtige Energieerzeugungswege der Zellen liefern, indem es die OCR (Sauerstoffverbrauchsrate), einen Indikator für die mitochondriale OXPHOS-Aktivität, und ECAR (extrazelluläre Ansäuerungsrate), die ein Indikator für die Glykolyse ist, misst. Makrophagen können beide Wege nutzen, abhängig von ihrer Mikroumgebung. Sie können auch ihre Energieerzeugungspfade umschalten...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Wir danken Frau Joanna Rocha für die redaktionelle Unterstützung. Die Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (NIH) R01DK118334 (an Dr. Sun und Alaniz) und (NIH) R01A11064Z (an Dr. Jayaraman und Alaniz) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
23G needles | VWR | BD305145 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
50ml Conical Tube | VWR | 21008-951 | |
ACK lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | It can be lab-made |
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide | Agilent Technologies | 103020-400 | |
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit | Agilent Technologies | 103344-100 | |
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide | Agilent Technologies | 103344-100 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody | BioLegend | 141710 | |
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug | eBioscience | 48-0112-82 | |
BD 3ML - SYRINGE | VWR | BD309657 | Other syringes are acceptable too |
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System | BECKMAN COULTER Life Sciences | 731050 | Cells can be manually counted too |
Cell Strainer-70µm | VWR | 10199-656 | |
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | C7026 | |
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7 | eBioscience | 25-4801-82 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20 | BD | 656385 | |
Kim Wipes | VWR | 82003-822 | |
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg | Invivogen | tlrl-smlps | |
MCSF | Peprotech | 315-02 | |
Murine IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
PE Rat Anti-Mouse CD38 | BD Biosciences | 553764 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Petri Dish 100mm x 15 mm | Fisher Scientific | F80875712 | |
RPMI, Glutamax, HEPES | Invitrogen | 72400-120 | |
Seahorse Calibrant Solution | Agilent Technologies | 103059-000 | |
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit | Agilent Technologies | 103344-100 | |
Seahorse XFe96 FluxPaks | Agilent Technologies | 102416-100 | |
XF Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red | Agilent Technologies | 103336-100 |
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