Комплексный высокоэффективный протокол для выделения, культивирования, поляризации и гликолитической характеристики макрофагов, полученных из костного мозга

Резюме

Этот протокол содержит подробные и всесторонние методы выделения, культивирования, поляризации и измерения гликолитического метаболического состояния живых макрофагов, полученных из костного мозга (МПДМ). В этом документе представлены пошаговые инструкции с реалистичными визуальными иллюстрациями для рабочего процесса и гликолитической оценки BMDM в режиме реального времени.

Аннотация

Макрофаги являются одними из наиболее важных антигенпрезентирующих клеток. Многие подмножества макрофагов были идентифицированы с уникальными метаболическими сигнатурами. Макрофаги обычно классифицируются как М1-подобные (воспалительные) и М2-подобные (противовоспалительные) подтипы. М1-подобные макрофаги являются провоспалительными макрофагами, которые активируются ЛПС и/или провоспалительными цитокинами, такими как INF-γ, IL-12 и IL-2. М1-подобные поляризованные макрофаги участвуют в различных заболеваниях, опосредуя защиту хозяина от различных бактерий и вирусов. Это очень важно для изучения индуцированных ЛПС М1-подобных макрофагов и их метаболических состояний при воспалительных заболеваниях. М2-подобные макрофаги считаются противовоспалительными макрофагами, активируемыми противовоспалительными цитокинами и стимуляторами. В провоспалительном состоянии макрофаги демонстрируют повышенный гликолиз в гликолитической функции. Гликолитическая функция активно исследовалась в контексте гликолиза, гликолитической емкости, гликолитического резерва, компенсаторного гликолиза или негликолитического подкисления с использованием анализаторов внеклеточного потока (XF).

В этой статье показано, как оценить гликолитические состояния в режиме реального времени с помощью простых шагов, когда макрофаги, полученные из костного мозга (МПДМ), дышат, потребляют и производят энергию. Используя специфические ингибиторы и активаторы гликолиза в этом протоколе, мы показываем, как получить системное и полное представление о гликолитических метаболических процессах в клетках и обеспечить более точные и реалистичные результаты. Чтобы иметь возможность измерять несколько гликолитических фенотипов, мы предлагаем простой, чувствительный, основанный на ДНК метод нормализации для поляризационной оценки МПДМ. Культивирование, активация/поляризация и идентификация фенотипа и метаболического состояния МПК являются важнейшими методами, которые могут помочь в исследовании многих различных типов заболеваний.

В этой статье мы поляризовали наивные макрофаги M0 на М1-подобные и М2-подобные макрофаги с ЛПС и ИЛ4 соответственно и измерили полный набор гликолитических параметров в МПДМ в реальном времени и в лонгитюдном течении, используя анализ внеклеточного потока и гликолитические активаторы и ингибиторы.

Введение

Макрофаги являются одними из наиболее важных клеток врожденной иммунной системы M1-подобной. Они участвуют в устранении инфекционных заболеваний, фагоцитозе, презентации антигенов и регуляции воспаления². Кроме того, макрофаги необходимы для регуляции других иммунных клеток с помощью различных цитокинов, которые они выделяют³. Существует большой спектр фенотипов макрофагов⁴. В зависимости от сигналов, которым подвергаются макрофаги, они поляризуются в сторону различных воспалительных и метаболических состояний⁵. Макрофаги проявляют метаболические изменения при различных заболеваниях, в зависимости от того, в какой ткани находятся макрофаги⁶. Поляризованные макрофаги обладают способностью перепрограммировать или переключать свой гликолитический метаболизм, липидный обмен, метаболизм аминокислот и митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS)^7,8. Классически активированные М1-подобные макрофаги и альтернативно активированные М2-подобные макрофаги являются двумя наиболее изученными фенотипами макрофагов³. Неактивированные покоящиеся макрофаги называются макрофагами M0. Поляризация М0-макрофагов в сторону М1-подобного фенотипа может быть индуцирована стимуляцией наивных МПДМ бактериальным липополисахаридом (ЛПС)⁹. Сигнальный путь PI3K-AKT-mTOR-HIF1a может быть активирован в макрофагах в присутствии воспалительных цитокинов, интерферона-гамма (ИФН γ,) или фактора некроза опухоли (TNF)¹⁰. М1-подобные макрофаги имеют повышенный уровень метаболизма гликолиза, сниженный уровень окислительного фосфорилирования (OXPHOS), продукцию воспалительных цитокинов, участвующих в инфекционных и воспалительных заболеваниях⁸. С другой стороны, поляризация в сторону М2-подобного фенотипа может быть индуцирована интерлейкином (IL)-4 через пути JAK-STAT, PPAR и AMPK или (IL)-13 и TGFβ pathays^11,12.

В отличие от М1-подобных макрофагов, М2-подобные макрофаги имеют пониженный гликолиз и повышенный OXPHOS, а также участвуют в антипаразитарной и тканевой репарирующей активности ^8,13. МПДМ являются широко используемой системой для изучения макрофагов, полученных из стволовых клеток костного мозга. Гликолиз и OXPHOS являются двумя ведущими путями производства энергии в клетках¹⁴. В зависимости от микроокружения BMDM могут использовать любой из этих путей; В некоторых случаях переключайтесь с одного на другой или используйте оба пути¹⁴. В этом исследовании мы сосредоточились на метаболизме гликолиза в активированных провоспалительных макрофагах. Когда глюкоза в цитоплазме превращается в пируват, а затем в лактат, клетки вырабатывают в этой среде протоны, которые вызывают повышение скорости подкисления в окружающей среде М1-подобных^{клеток.} Для измерения скорости подкисления клеточных сред использовался анализатор внеклеточного потока. Результаты представлены в виде скорости внеклеточного закисления (ECAR) или скорости оттока протонов.

Оптимизированный, быстрый и простой метод доступа к уровням гликолиза в поляризованных макрофагах необходим для определения гликолитического фенотипа, изменений метаболитов и влияния ингибиторов/активаторов и лекарств на поляризованные макрофаги. Метод, описанный в данной рукописи, был оптимизирован для получения информации о конкретных факторах гликолиза (гликолиз, гликолитическая емкость, гликолитический резерв и негликолитическое подкисление), а также о метаболическом перепрограммировании гликолитического метаболизма. Ингибитор (2DG), который использовался в этом исследовании, явно нацелен на путь гликолиза.

Этот оптимизированный протокол был модифицирован и усовершенствован на основе комбинации опубликованного протокола¹⁶, анализа внеклеточного потока гликолитических анализов из руководств пользователя производителя и прямого общения с учеными производителя в области исследований и разработок.

протокол

Мыши были гуманно принесены в жертву в соответствии с рекомендациями Оценки и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC) и Американской ассоциации науки о лабораторных животных (AALAS) и с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Техасского университета A&M (IACUC).

1. Мыши, сбор костного мозга и культивирование МПДМ

1. Принесите в жертву мышь (в возрасте 6-10 недель C57Bl/6 мышей входили в этот протокол) и положите ее на вентральную сторону, разрежьте кожу и брюшинный слой и аккуратно снимите с лапок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте воздействие газа CO₂ для усыпления мыши.
2. Отделите обе задние ноги от бедра вниз, стараясь не порезать кость.
3. Поместите всю ногу в пустую коническую трубку объемом 50 мл (ногами вверх, чтобы их было удобно вытащить позже) на лед и продолжайте собирать обе ноги с мыши.

2. Обнажение бедренной кости

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в шкафу биобезопасности.

1. Соберите бедренную кость, отрезав большеберцовую кость с каждой ноги и удалив как можно больше ткани вокруг бедренной кости с помощью ножниц и лабораторной бумаги.
2. Заготовленные, «очищенные» бедренные кости поместите в 10-сантиметровую пластину, содержащую лист лабораторной бумаги, пропитанный питательной средой (ТК) или ПБС. Выложите их на лед.
3. Продолжайте забор бедренных костей и удаляйте ткани со всех бедренных костей, прежде чем перейти к этапу промывки (Рисунок 1A).

3. Промывка костного мозга

1. Чтобы промыть костный мозг из бедренной кости, используйте шприц объемом 3 мл, наполненный средой TC или PBS с иглой 23G. Наполните шприц перед тем, как обнажить костный мозг.
2. С помощью ножниц обнажите костный мозг, разрезав самый конец бедренной кости на обоих эпифизах.
3. Вставьте кончик иглы в бедренную кость и аккуратно промойте костный мозг в посуду диаметром 10 см.
4. Проведите иглой по всей длине бедренной кости и промывайте до тех пор, пока цвет кости не станет белым. Как правило, большую часть костного мозга можно промыть с помощью 2-3 мл среды.
5. Промойте все бедренные кости и бассейн костного мозга в чашке. С помощью иглы разбейте все видимые комки. Процедите костный мозг в коническую пробирку объемом 50 мл (рис. 1A).

4. Лизис эритроцитов

1. Отжим костный мозг при 190 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируйте гранулу в 4 мл буфера для лизиса ACK с помощью пипетки. Дайте буферу для лизиса эритроцитов подействовать в течение 5 минут при комнатной температуре.
3. Добавьте 4 мл среды ТК RPMI-C 10% (RPMI 1640-GlutaMAX) с добавлением 2-меркаптоэтанола, гентамицина, стрептомицина и 10% FCS в суспензию костного мозга и отвертите при 1300 x g в течение 10 мин.
4. Еще раз процедите, чтобы удалить мусор эритроцитов, и снова суспендируйте в небольшом объеме RPMI-C 10% для подсчета.
5. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек (рисунок 1B). Для определения количества и жизнеспособности клеток в суспензии использовали счетчик Vi-клеток.

5. Сервировка и культура

1. Добавьте 10 мл RPMI-C 10% + 10 нг/мл m-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор, важный регулятор пролиферации, дифференцировки и выживаемости моноцитов/макрофагов) в любое количество 10-сантиметровых пластин.
2. Прибавьте соответствующий объем подсчитанных ячеек так, чтобы каждая пластина длиной 10 см содержала 1 x 10⁶ ячеек. Поместите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C (определяется как день 0).
3. На 3-й день аккуратно добавьте 5 мл свежего RPMI-C 10% + 10 нг/мл M-CSF в каждую тарелку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На 7-й день БМДМ должны быть готовы к испытаниям (Рисунок 1C).

6. Сбор урожая с тарелок

1. Используйте световой микроскоп, чтобы подтвердить, что большинство клеток прилипли к пластинам.
2. Аккуратно аспирируйте среду. Затем добавьте 3 мл PBS и аккуратно перемешайте пластину. Хорошо аспирируйте его, чтобы удалить все оставшиеся неадгезивные клетки.
3. Добавьте в планшет 7-10 мл холодного PBS, с помощью пипетки P1000 промойте дно пластин и соберите все оставшиеся клетки в пробирку для сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пробирки на льду, так как макрофаги очень плотно прилегают и прилипают к внутренней части пробирки. Если бы клетки оставались холодными, они были бы менее плотно прилегающими.
4. Центрифуга, счетные и планшетные ячейки для экспериментов (рис. 1D). С помощью проточной цитометрии полученные клетки должны быть на >95% положительными к CD11b и F4/80. (поляризацию макрофагов определяли путем окрашивания М1-подобными маркерами CD38, TNF-a и MCP-1 и М2-подобным маркером CD206.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 6.1-6.3 в шкафу биобезопасности и выполните шаг 6.4 на столе. Придерживайтесь асептических техник на протяжении всей процедуры.

Рисунок 1: Графический процесс культивирования костного мозга мышей из макрофагов, полученных из BM. (A) Забор ножки, обнажение бедренной кости и промывка костного мозга; (b) лизис эритроцитов; (В) Сервировка и культура; (D) Забор клеток из планшетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. За день до анализа метаболического потока: посев и поляризация клеток для гликолитического теста

1. Нагрейте анализатор метаболических потоков до 37 °C, включив прибор.
2. Увлажните картридж, добавив 200 μL раствора Calibrant, и инкубируйте картридж в инкубаторе без_CO2 на ночь (рис. 2A). Влажность в инкубаторе без CO₂ не имеет значения для гидратации картриджа.
   1. За час до эксперимента опустите пластину несколько раз вверх и вниз, что поможет удалить пузырьки воздуха.
3. Разработайте карту планшета в программном обеспечении в стандартном стресс-тесте гликолиза - острой инъекции, следуя инструкциям теста.
   1. Нажмите на значок программного обеспечения, а затем нажмите на Гликолиз стресс-острый инъекционный тест. На значке определения группы сгенерируйте имена групп.
4. Существует пять циклов измерения продолжительностью 18 минут и четыре инъекции. Измените инъекцию порта А на глюкозу, порта В на олигомицин, порта С на ротенон и антимицин А (Rot/AA), а порт D на 2DG.
5. Повторно суспендировать клетки в RPMI-C в 10% среде и затравке 50k клеток на лунку, за исключением четырех краев планшета (A1, A12, H1 и H12; Добавьте только среды, без клеток) в микропланшет анализатора метаболического потока до конечного объема 100 μл. Обычно для проведения этого анализа требуется минимум 40 тыс. клеток.
6. Дайте клеткам постоять при комнатной температуре в течение 45 минут, чтобы избежать краевого эффекта клеток. Краевой эффект возникает, когда среда по периметру пластины частично испаряется, что вызывает изменения объема и концентрации и снижает жизнеспособность клеток.
7. Добавьте 10 нг/мл ЛПС, чтобы поляризовать наивные макрофаги в сторону М1-подобных клеток, и добавьте 20 нг/мл IL-4, чтобы поляризовать их в сторону М2-подобных клеток. Используйте не менее 3–6 скважин для каждого условия (Рисунок 2B).
8. Проверьте клетки под микроскопом и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 24 часа.

Рисунок 2: Графическая демонстрация затравки и поляризации ячеек. (A) Настройка анализатора внеклеточного потока и гидратация картриджа; (Б) Поляризация клеток и ночная инкубация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. День проведения анализа: XF Medium и комбинированный препарат

1. Дополните 100 мл среды для анализа XF RPMI (pH 7,4) 2 мМ глутамина.
2. Фильтруйте и стерилизуйте фильтрующий материал с помощью вакуумной фильтрующей системы 0,2 мкм.
3. Поместите пробирный материал на водяную баню при температуре 37^°C на 20 минут.
4. Извлеките металлизированные клетки из инкубатора с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Дважды промыть ячейки пробирной средой и заменить предыдущую среду на пробирную среду до конечного объема 180 μл.
5. С помощью микроскопа убедитесь, что во всех лунках есть сливающиеся клетки, и отметьте все лунки, на которых есть царапины от пипетирования. Если есть царапины, снимите эту пластину перед анализом.
6. Поместите камеру, содержащую клетки, в инкубатор без CO₂ на 45 минут (рисунок 3A).
7. Использование соединений и тестовых сред для получения исходных растворов глюкозы (100 мМ), олигомицина (100 мкМ), Rot/AA (50 мкМ) и 2DG (500 мМ) (Таблица 1).
8. Сделайте 10-кратное инъекционное введение смеси каждого соединения с использованием пробирного материала (Таблица 2).

Инъекционные приклады (предоставляются в комплектах)	Добавить Полная пробирная среда (мл)	Конечная концентрация запаса (μM)
Глюкоза	3	100 тыс.
Олигомицин	0.72	100
2-ДГ	3	100 тыс.

Таблица 1. Инъекционные заготовки

Порты на картридже	Стоковые решения	Добавить объем складских запасов	Добавить пробирный материал	Конечная концентрация инъекций (10x)	Добавьте этот объем к указанному порту (μL)	Конечная концентрация после закачки в каждую скважину
A	Глюкоза (100 мМ)	3000 мкл + 0 мкл		100 мМ	20	10 мМ
B	Олигомицин (100 мкМ)	300 мкл + 2700 мкл		10 μМ	22	1,0 мкМ
C	Ротенон/антимицин А (50 мкМ)	300 мкл + 2700 мкл		5 мкМ	25	0,5 мкМ
D	2-ДГ (500 мМ)	300 мкл + 0 мкл		500 мМ	28	50 мМ

Таблица 2. Концентрации при окончательном впрыске

9. День проведения анализа: Проведение острого гликолитического теста на поляризованных макрофагах

1. Откройте сохраненный шаблон анализа напряжения гликолиза (острая инъекция) из программного обеспечения. Стандартный тест на острый гликостресс-тест включает 3 минуты смешивания и измерения перед каждой инъекцией.
2. Проверьте шаблон и детали анализа, а когда будете готовы, нажмите «Выполнить» и следуйте инструкциям анализа по умолчанию. Тем не менее, все параметры можно настроить.
3. Извлеките картридж датчика из инкубатора, не содержащего CO₂ , снимите крышку и вставьте прибор таким образом, чтобы отверстие A1 пластины картриджа попадало в верхний левый угол панели вставки машины. Обычно калибровка занимает от 20 до 45 минут.
4. После завершения калибровки устройство извлечет пластину, содержащую раствор калибра, и будет удерживать картридж датчика. Снимите калибр, в котором находится пластина.
5. Извлеките клеточную пластину из инкубатора, не содержащего CO₂ , снимите крышку пластины и вставьте ее в машину. Нажмите кнопку "Выполнить" (рисунок 3B).
6. Когда анализ будет завершен, машина извлечет клеточную пластину и картридж датчика.
7. Снимите носитель с плиты и заморозьте его при температуре -20 °C для дальнейшей нормализации.
8. Используйте коммерческий набор для анализа пролиферации клеток (например, CyQUANT) для нормализации клеток.
9. Добавьте 1 мл соединения B или буфера для лизиса в 19 мл дистиллированной воды, не содержащей нуклеаз.
10. Добавьте в указанный раствор 100 μл рабочего раствора Соединения А или GR.
11. Убедитесь, что ячейки в планшете размораживаются, а затем добавьте по 200 мкл раствора в каждую лунку.
12. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
13. Измерьте флуоресценцию на длинах волн возбуждения 480 нм и длинах волн излучения 520 нм с помощью считывателя пластин.
14. Нормализуйте ячейки на панели нормализации программного обеспечения.
15. Нормализация клеток на основе наивного количества клеток макрофагов (рисунок 3C). Примите среднее значение наивных макрофагов как 1 (разделив число клеток каждой лунки на среднее число клеток наивных макрофагов) и примените его ко всем макрофагам.

Рисунок 3: День проведения анализа: приготовление сред и соединений и проведение анализа. (A) Подготовка клеток к анализу; (В) Приготовление соединений, калибровка и проведение анализа; (C) Нормализация и анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Гликолиз и митохондриальное окислительное фосфорилирование являются двумя основными путями производства АТФ в клетках (рисунок 4A). Некоторые клетки обладают способностью переключаться между этими двумя путями для удовлетворения с...

Обсуждение

Как упоминалось ранее, анализатор внеклеточного потока может предоставлять информацию в режиме реального времени о двух основных энергетических путях клеток, измеряя OCR (скорость потребления кислорода), показатель активности митохондриального OXPHOS, и ECAR (скорость вн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100