简化新生早产儿经皮气管内药物输送

摘要

经皮气管内注射可在自主呼吸期间进行有效的肺内药物输送。单次和多次注射耐受性良好，对生存没有影响。该技术作简单，可以检查物质对新生兔肺发育和肺损伤预防的影响。

摘要

气管内 （IT） 药物输送允许将药物物质直接输送到肺部，最大限度地提高潜在的肺益处并最大限度地减少全身药物暴露。经皮技术很简单，允许在早产兔出生后不久将物质 IT 输送到肺部。新生幼崽用吸入异氟醚麻醉，然后置于仰卧位并伸展颈部。在经皮将 26 号 （G） 导管放入气管之前，确定并稳定喉部。气管导管插入后，将连接到 Hamilton 注射器的 30 G 钝针引入 IT 导管，用于在自主呼吸期间将精确体积输送到气管中。IT 注射完成后，拔出针头和导管，让幼犬从麻醉中恢复。经皮 IT 注射将大部分注射物质输送到肺部，大部分在干预后 3 小时留在肺部。注射从出生之日起就具有良好的耐受性，并且可以连续重复多天而不影响生存。该技术可用于研究药物对早产儿肺发育和预防新生儿肺损伤的影响。

引言

早产后的慢性新生儿肺病 （CNLD） 继续发生在大量婴儿^{中 1}。改进的现代新生儿保健显著提高了生存率，并减少了早产后大多数重大并发症。虽然神经、胃肠道和眼科并发症有所减少，但在过去 2 年中，呼吸系统并发症基本保持不变，近 2/2 的婴儿在妊娠 28 周之前出生时发展为肺部疾病。

早产、炎症、氧化损伤和呼吸机相关损伤都在 CNLD 的病理生理学和早产后不良呼吸结局中发挥作用 ^2,3,4。尽管现代新生儿护理取得了重大进步，但可用于治疗或预防 CNLD 发展的有效疗法有限 ^5,6。

需要新的方法和干预措施来开发预防和治疗 CNLD 的疗法。肺内药物输送是一种有吸引力的干预措施，可将药物输送到肺部，并可能改变新生儿呼吸系统疾病的病程。肺内药物治疗的好处是活性药物直接输送到肺部，从而最大限度地减少药物在脱靶器官中的积累 ^7,8，从而可能限制全身副作用。尽管肺内表面活性剂替代治疗已超过 2 年，但尚未验证其他肺内药物可改善新生儿呼吸结局。最近，布地奈德-表面活性剂联合疗法已被描述可以改善机械通气婴儿早产后的肺部结局 ^9,10。然而，关于 IT 药物治疗的功能和结构影响仍有很多未知数，几乎没有新疗法被发现，气管内给药在新生儿期的价值仍不确定。需要动物模型来识别潜在药物并帮助开发急需的 CNLD 疗法。

检查新生儿肺病的动物研究最常在大鼠和小鼠等小动物模型中进行 11,12,13。兔子具有早产的额外优势，可以更接近地模拟未成熟人肺的结构和功能¹⁴。早产兔的局限性是难以进入气道以进行肺内介入治疗。虽然成年兔和啮齿动物模型允许经口气管插管，但由于它们的体积小且上气道的独特解剖结构，这些技术在新生幼仔中很困难^15,16。需要替代方法以允许进入气管以在新生兔幼崽中输送药物。

在这份手稿中，我们描述了使用经皮针式气管切开术进行气管插管和药物输送。

研究方案

对于所有涉及 IT 注射的实验，已寻求鲁汶大学动物伦理委员会的许可，并遵守鲁汶大学的所有动物福利和护理准则。

1. 准备工作

1. 收集完成 IT 注入所需的所有材料（表 1）。
2. 确保麻醉室的排气口打开并连接到清除剂，以防止研究人员接触异氟醚。

2. 幼崽的交付

注意：兔幼崽（新西兰白佛兰德巨型杂交种）在妊娠第 28 天（足月第 31 天）通过子宫切开术分娩，处于我们第¹⁷ 组之前描述的肺发育的囊状阶段。幼崽可以放置在常氧状态以研究早产后的肺部发育，也可以放置在高氧状态以研究急性肺损伤。

1. 用 2 mL 注射器和 26 G 针头将 1 mL 氯胺酮 （100 mg/mL） 和 1 mL 甲苯噻嗪 （2%） 肌肉注射到股四头肌，使镇静坝。深度镇静后，将 dam 置于手术台上的仰卧位。通过深呼吸缓慢、下颌张力降低和对捏耳无反应来证实充分麻醉。
2. 用电动剃须刀剃除中央腹部，并用碘基溶液对手术区域进行消毒。
3. 通过在耳朵的外侧静脉中静脉推注 1 mL T61 对 dam 实施安乐死。
4. 立即通过皮肤、肌肉鞘和腹部肌肉进行腹部中线切口，进入腹腔。
5. 延长切口以露出双角子宫。
6. 立即用一把剪刀在子宫上切开一个切口，然后通过子宫切开术分娩每只幼崽。幼崽的快速交付对于确保生存至关重要。
7. 交货时，用纸巾擦干每只幼犬，这既可以干燥又可以刺激幼犬。
8. 将干燥的幼崽放入温暖 （36 °C）、加湿（50% 相对湿度）的培养箱中。
9. 允许 1 小时进行恢复并过渡到宫外环境。所有幸存的幼崽被随机分配到预定的治疗组。

3. 麻醉

1. 用异氟醚（2.5%，2.5 最小肺泡浓度 （MAC），2 L / min）淹没感应室
2. 将幼崽放入诱导室中，直到达到足够的麻醉水平（自发运动减少，对疼痛刺激的足部反射减弱，呼吸频率降低）。
   注意：兔幼崽的眼睛在胎龄 28 天时不睁开（如本实验所示），因此，不需要局部眼膏来防止角膜干燥。如果在以后的生活中进行 IT 注射，则应将主题软膏涂抹在睁开的眼睛上。

4. 气管内注射的定位

1. 将幼犬放在安装台上，仰卧，伸长脖子，将鼻子插入鼻腔以提供持续的麻醉。
2. 使用非拉伸胶带将幼犬的爪子绑在安装台上。
3. 识别气管软骨环和喉软骨环，它们在胸廓入口上方的上气管中线可见深色皮下中线结构。
4. 用酒精溶液（80% 乙醇溶液）对气管上的皮肤进行消毒
5. 用作者的非惯用手用 Allis 镊子抓住并稳定喉部。

5. 进行气管内注射（图 1）

1. 准备用 26 G 静脉插管插管（最好用惯用手进行），同时用 Allis 镊子稳定气管。
   注意：为确保程序的无菌性，请为每只幼崽使用新的无菌套管。
2. 用套管与甲状软骨水平的皮肤成 45° 角穿透皮肤。
3. 缓慢推进套管和管心针，直到气管插管，当针头穿过气管并进入气道管腔时，会感觉到微妙的“给予”。
4. 一旦带有管心针的套管进入气管腔，停止推进管心针，并在保持管心针静止的同时将塑料套管穿过管心针推进到气管中。不要将塑料套管推进 >10 毫米或选择性插管左主支气管或右主支气管有风险。
5. 从套管中取出管心针，将塑料套管护套留在气管中。
6. 通过使用 Hamilton 注射器和 30 G 钝针将少量生理盐水（0.9% NaCl，5 μL）注入套管中，确认套管的 IT 位置。将盐水注射到套管中后，取出 Hamilton 注射器和针头。观察塑料套管内的气液面;自主呼吸时套管中空气-水位的运动证实了套管在气道内的位置。
7. 使用 30 G 钝头针头将所需量的物质吸入 Hamilton 注射器中。
8. 将 30 G 钝头针头（连接到汉密尔顿注射器）引入塑料套管（在气管中），并在 5-10 秒内缓慢将物质注射到气管中。
9. 从塑料套管上取下 Hamilton 注射器针头，从气管上取下塑料套管。

6. 从程序中恢复

1. 将幼犬从安装阶段解放出来，并通过对幼犬的触觉刺激来刺激呼吸。
2. 将幼崽放回未麻醉的幼犬笼中的单独笼子中，在温暖 （36 °C）、加湿（50% 相对湿度）培养箱中;置于 30° 头朝上位置，直到从麻醉中充分恢复并能够维持胸骨斜躺。在幼犬从麻醉剂中恢复之前，不要让它们无人看管。

结果

每日单次和重复经皮 IT 注射技术的代表性结果已经发表，表明与对照组相比，IT 注射（单次或多次注射）不会影响生存率，与对照组相比，安慰剂（生理盐水）的 IT 注射也不会改变肺功能或肺结构¹⁸。

此外，我们还在一系列实验中验证了该技术，这些实验在两个时间点（注射后 10 分钟和 150 分钟）使用放射性示踪剂（2-脱氧-2-[18F]?...

讨论

要成功执行 IT 注入，应遵循几个关键步骤。如果作正确，经皮 IT 注射方法可以在早产儿兔中有效可靠地进行肺内药物输送。温度控制很重要，因为新生幼崽很容易体温过低，这会对生存产生负面影响。在将幼崽放入诱导室之前，应确保温度控制以保持正常体温条件。放置在感应室下方的加热垫可确保幼崽保持温暖。在将幼崽放入感应室之前，加热垫已经打开，让加热室?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used