신생아 조산토끼의 경피내 기관내 약물 전달 단순화

요약

경피적 기관내 주사는 자발적 호흡 중에 효과적인 폐내 약물 전달을 가능하게 합니다. 단일 및 다중 주사는 생존에 영향을 미치지 않고 잘 견딥니다. 이 기술은 수행이 간단하며 신생아 토끼의 폐 발달 및 폐 손상 예방에 대한 물질의 영향을 조사할 수 있습니다.

초록

기관내(IT) 약물 전달을 통해 제약 물질을 폐에 직접 전달할 수 있어 잠재적인 폐 이점을 극대화하고 전신 약물 노출을 최소화할 수 있습니다. 경피 기술은 간단하며 출생 직후 조산한 토끼의 폐로 물질을 IT 전달할 수 있습니다. 갓 태어난 새끼는 목을 펴고 누운 자세로 놓기 전에 흡입된 이소플루란으로 마취됩니다. 후두는 26게이지(G) 카테터를 기관에 경피적으로 삽입하기 전에 확인되고 안정화됩니다. 기관 카테터 삽입 후 Hamilton 주사기에 부착된 30G의 뭉툭한 바늘을 IT 카테터에 삽입하고 자발적 호흡 중에 기관으로 정확한 볼륨을 전달하는 데 사용됩니다. IT 주사가 완료된 후 바늘과 카테터를 빼고 강아지가 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 경피적 IT 주사는 주입된 물질의 상당 부분을 폐로 전달하며, 대부분은 중재 후 3시간 후에 폐에 남아 있습니다. 주사는 출생 당일부터 잘 견디며 생존에 영향을 미치지 않고 며칠 동안 연속으로 반복할 수 있습니다. 이 기술은 폐 발달에 대한 약제의 효과를 조사하고 조산토끼의 신생아 폐 손상 예방에 사용할 수 있습니다.

서문

조산에 따른 만성 신생아 폐질환(CNLD)은 상당수의 영아에서 계속 발생하고 있다¹. 현대의 개선된 신생아 관리는 생존율을 현저히 증가시켰고, 조산에 따른 대부분의 심각한 합병증을 감소시켰다. 신경학적, 위장적, 안과적 합병증은 감소했지만, 호흡기 합병증은 지난 20년 동안 크게 변하지 않았으며, 임신 28주 이전에 태어난 영아 2명 중 1명에서 폐 질환이 발병하고 있습니다.

미숙아, 염증, 산화 손상, 인공호흡기 관련 부상은 모두 CNLD의 병태생리학에 영향을 미치고 조산 후 호흡기 예후가 좋지 않은 경우 ^2,3,4. 현대 신생아 치료의 상당한 발전에도 불구하고 CNLD의 발병을 치료하거나 예방할 수 있는 효과적인 치료법은 제한적입니다 ^5,6.

CNLD를 예방하고 치료하기 위한 치료법을 개발하기 위해서는 새로운 접근법과 개입이 필요하다. 폐 내 약물 전달은 약물을 폐로 전달하기 위한 매력적인 중재이며 신생아의 호흡기 질환 진행을 변화시킬 수 있습니다. 폐내 약물 요법은 활성 제제를 폐에 직접 전달하여 off-target 장기에 약물 축적을 최소화하는 이점이 있으며^7,8 전신 부작용을 잠재적으로 제한할 수 있습니다. 20년 이상의 폐내 계면활성제 교체에도 불구하고 신생아 호흡기 결과를 개선하기 위해 추가로 폐 내 약물이 검증되지 않았습니다. 최근에는 부데소니드-계면활성제 병용 요법이 기계적으로 환기된 영아의 조산 후 폐 결과를 개선하기 위해 설명되었습니다 ^9,10. 그러나 IT 약물 요법의 기능적 및 구조적 효과에 대해서는 아직 많은 것이 알려지지 않았고, 새로운 치료법은 거의 확인되지 않았으며, 신생아 시기에 기관내 약물 전달의 가치는 여전히 불확실합니다. 동물 모델은 잠재적인 약물을 식별하고 CNLD에 필요한 치료법 개발을 돕기 위해 필요합니다.

신생아 폐 질환을 조사하는 동물 연구는 쥐 및 생쥐와 같은 작은 동물 모델에서 가장 일반적으로 수행됩니다^{11 , 12 , 13} . 토끼는 미성숙한 인간 폐의 구조와 기능을 더 밀접하게 모방할 수 있는 조산이라는 추가적인 이점을 가지고 있다¹⁴. 조산토끼의 한계는 폐내 중재술을 전달하기 위해 기도에 접근하기가 어렵다는 것입니다. 다 자란 토끼와 설치류 모델은 경구강 기관내 삽관을 허용하지만, 이러한 기술은 작은 크기와 상기도의 독특한 해부학적 구조로 인해 신생아에게는 어렵습니다^15,16. 갓 태어난 새끼 토끼에서 약물을 전달하기 위해 기관에 접근할 수 있도록 하려면 대체 접근법이 필요합니다.

이 원고에서는 기관 삽관 및 약물 전달을 가능하게 하기 위해 경피적 바늘 기관절개술을 사용하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

IT 주입과 관련된 모든 실험은 고려대학교 동물윤리위원회의 허가를 구했으며, 고려대학교 루벤의 동물 복지 및 관리에 관한 모든 지침을 준수했습니다.

1. 준비

1. IT 주입을 완료하는 데 필요한 모든 재료를 수집합니다(표 1).
2. 연구자가 Isoflurane에 노출되지 않도록 마취실의 배기 장치가 열려 있고 청소부에 연결되어 있는지 확인하십시오.

2. 새끼 출산

참고: 새끼 토끼(뉴질랜드 화이트-플랑드르 자이언트 하이브리드)는 앞서 그룹¹⁷에서 설명한 폐 발달의 주머니 단계에서 임신 28일(텀 31일)에 자궁절개술을 통해 분만되었습니다. 새끼는 조산 후 폐 발달을 연구하기 위해 정상 산소에 배치하거나 급성 폐 손상을 연구하기 위해 고산소에 배치할 수 있습니다.

1. 2mL 주사기와 26G 바늘로 대퇴사두근에 전달되는 1mL 케타민(100mg/mL) 및 1mL 자일라진(2%)을 근육 주사로 진정시킵니다. 깊이 진정되면 댐을 수술대에 누운 위치에 놓습니다. 적절한 마취는 깊고 느린 호흡, 턱 긴장도 감소, 귀 꼬집음에 대한 반응 부족으로 확인됩니다.
2. 전기 면도기로 중앙 복부를 면도하고 요오드 기반 용액으로 수술 부위를 살균합니다.
3. 귀의 외측 정맥으로 전달되는 1mL의 T61 볼루스를 정맥 주사하여 댐을 안락사시킵니다.
4. 즉시 피부, 근육초, 복부 근육을 통해 복강 안으로 정중선 복부 절개를 수행합니다.
5. 절개 부위를 확장하여 이각자궁이 드러나도록 합니다.
6. 즉시 가위를 사용하여 자궁을 절개하고 자궁 절개술을 통해 각 새끼를 분만합니다. 새끼의 빠른 출산은 생존을 보장하는 데 필수적입니다.
7. 배송 시 종이 타월을 사용하여 각 강아지를 말리면 강아지가 건조되고 자극됩니다.
8. 건조된 강아지를 보온(36°C), 가습(상대 습도 50%) 인큐베이터에 넣습니다.
9. 회복하고 자궁 외 환경으로 전환하는 데 1시간을 허용합니다. 살아남은 모든 새끼는 미리 결정된 치료 그룹에 무작위 배정됩니다.

3. 마취

1. 유도 챔버를 Isoflurane(2.5%, 2.5 최소 폐포 농도(MAC), 2L/min)으로 가득 채웁니다.
2. 적절한 수준의 마취가 이루어질 때까지 강아지를 유도실에 눕힙니다(자발적 움직임 감소, 고통스러운 자극에 대한 발 반사 감소, 호흡수 감소).
   참고: 새끼 토끼의 눈은 재태 연령 28일째에 뜨지 않으므로(이 실험에서와 같이) 각막의 건조를 방지하기 위해 국소 안연고가 필요하지 않습니다. 나중에 IT 주사를 맞을 경우 뜬 눈에 국소 연고를 도포해야 합니다.

4. 기관내 주사를 위한 포지셔닝

1. 강아지를 장착 스테이지에 놓고 목을 뻗은 상태에서 누운 자세로 코를 노즈콘에 삽입하여 지속적인 마취를 제공합니다.
2. 신축성이 없는 접착 테이프를 사용하여 강아지의 발을 고정하여 발을 장착 스테이지에 테이프로 붙입니다.
3. 기관 및 후두 연골 고리를 확인하며, 이는 흉부 입구보다 상부 기관에서 어두운 피하 정중선 구조로 볼 수 있습니다.
4. 알코올 용액(80% 에탄올 용액)으로 기관 위의 피부를 살균합니다.
5. 작업자의 주로 사용하지 않는 손으로 Allis 겸자로 후두를 잡고 안정시킵니다.

5. 기관내 주사 시행(그림 1)

1. 26G 정맥 캐뉼라(주로 사용하는 손으로 하는 것이 가장 좋음)로 기관을 캐뉼러할 준비를 하는 동시에 Allis 겸자로 기관을 안정화합니다.
   알림: 절차의 무균 상태를 보장하려면 각 강아지에 대해 새로운 멸균 캐뉼라를 사용하십시오.
2. 갑상선 연골 수준의 피부에 45° 각도로 캐뉼라로 피부를 관통합니다.
3. 기관이 캐뉼러가 될 때까지 캐뉼라와 탐침을 천천히 전진시키고, 바늘이 기관을 관통하여 기도 내강으로 들어갈 때 미묘한 "주기"가 느껴집니다.
4. 탐침이 있는 캐뉼라가 기관의 내강에 있으면 탐침의 전진을 멈추고 탐침을 고정한 상태에서 탐침 위의 플라스틱 캐뉼라를 기관으로 전진시킵니다. 플라스틱 캐뉼라를 >10mm 전진시키거나 왼쪽 또는 오른쪽 메인 기관지를 선택적으로 삽관하는 것은 위험합니다.
5. 캐뉼라에서 탐침을 빼내고 플라스틱 캐뉼라 덮개를 기관에 남겨둡니다.
6. Hamilton 주사기와 30G의 뭉툭한 바늘을 사용하여 소량의 생리식염수(0.9% NaCl, 5μL)를 캐뉼러에 주입하여 캐뉼라의 IT 위치를 확인합니다. 식염수가 캐뉼라에 주입되면 해밀턴 주사기와 바늘을 제거합니다. 플라스틱 캐뉼러 내부의 공기 유체 수준을 관찰하십시오. 자발적 호흡과 함께 캐뉼라의 공기-수분 수준의 움직임은 기도 내에 캐뉼라의 배치를 확인합니다.
7. 30G의 뭉툭한 바늘을 사용하여 Hamilton 주사기에 필요한 양의 물질을 빨아들입니다.
8. 30G의 뭉툭한 바늘(해밀턴 주사기에 부착됨)을 플라스틱 캐뉼라(기관에 있음)에 삽입하고 5-10초에 걸쳐 기관에 물질을 천천히 주입합니다.
9. 플라스틱 캐뉼러에서 Hamilton 주사기 바늘을 제거하고 기관에서 플라스틱 캐뉼라를 제거합니다.

6. 시술로부터의 회복

1. 마운팅 스테이지에서 강아지를 풀어주고 강아지의 촉각 자극으로 호흡을 자극합니다.
2. 새끼를 보온(36°C), 가습(50% 상대 습도) 인큐베이터에서 마취되지 않은 새끼 케이지와 별도의 케이지로 되돌립니다. 마취에서 충분히 회복되고 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 30° 헤드 업 자세로 놓습니다. 마취제에서 회복될 때까지 강아지를 방치하지 마십시오.

결과

1일 1회 및 반복 경피적 IT 주사 기법의 대표적인 결과가 발표되었으며, 생존율이 IT 주사(단일 또는 다중 주사)에 의해 영향을 받지 않았으며, 위약(식염수)을 사용한 IT 주사가 대조군에 비해 폐 기능이나 폐 구조에 변화를 주지 않았음을 입증했다¹⁸.

또한, 경피적 IT 주사를 사용하여 주입된 물질의 분포 및 폐 전달을 정량화하기 위해 ...

토론

IT 주입을 성공적으로 수행하려면 몇 가지 중요한 단계를 따라야 합니다. 경피적 IT 주사 방법을 올바르게 수행하면 조산토끼에게 효과적이고 신뢰할 수 있는 폐내 약물 전달이 가능합니다. 갓 태어난 새끼는 쉽게 저체온증에 빠져 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 온도 조절이 중요합니다. 강아지를 유도실에 넣기 전에 정상 온도 조건을 유지하기 위해 온도 제어...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used