Упрощение чрескожной интратрахеальной доставки лекарственных препаратов новорожденному недоношенному кролику

Резюме

Чрескожная интратрахеальная инъекция обеспечивает эффективную внутрилегочную доставку лекарств во время спонтанного дыхания. Однократные и многократные инъекции хорошо переносятся без влияния на выживаемость. Методика проста в исполнении и позволяет исследовать влияние веществ на развитие легких и профилактику повреждения легких у новорожденных кроликов.

Аннотация

Интратрахеальная (ИТ) доставка лекарственных препаратов позволяет осуществлять прямую доставку фармацевтических веществ в легкие, максимизируя потенциальную пользу для легких и сводя к минимуму системное воздействие лекарственных препаратов. Чрескожная техника проста и позволяет доставлять вещества в легкие недоношенных кроликов вскоре после рождения. Новорожденных детенышей обезболивают ингаляционным изофлураном перед тем, как поместить их в положение лежа на спине с вытянутой шеей. Гортань идентифицируется и стабилизируется перед чрескожным размещением катетера 26-го калибра (G) в трахею. После катетеризации трахеи в катетер IT вводится тупая игла массой 30 G, прикрепленная к шприцу Hamilton, которая используется для доставки точного объема в трахею во время спонтанного дыхания. После того, как инъекция IT завершена, игла и катетер извлекаются, и щенку дают восстановиться после анестезии. Чрескожная инъекция ИТ доставляет большую часть введенного вещества в легкие, причем большая часть остается в легких через 3 часа после вмешательства. Инъекции хорошо переносятся со дня рождения и могут повторяться в течение нескольких дней подряд без влияния на выживаемость. Эта методика может быть использована для исследования влияния фармацевтических препаратов на развитие легких и в профилактике неонатального повреждения легких у недоношенных кроликов.

Введение

Хроническое неонатальное заболевание легких (ХЛБ) после преждевременных родов продолжает встречаться у значительного числа младенцев¹. Усовершенствованная современная неонатальная помощь позволила значительно повысить выживаемость и снизить вероятность большинства значимых осложнений после преждевременных родов. В то время как неврологические, желудочно-кишечные и офтальмологические осложнения уменьшились, респираторные осложнения остаются в основном неизменными за последние 2 десятилетия, при этом почти у каждого второго младенца, родившегося до 28 недели беременности, развивается заболевание легких.

Недоношенность, воспаление, окислительное повреждение и травма, связанная с искусственной вентиляцией легких, играют роль в патофизиологии ХХЛД и плохих респираторных исходах после преждевременных родов ^2,3,4. Несмотря на значительные достижения современной неонатальной помощи, существует ограниченная эффективная терапия для лечения или предотвращения развития ХХЛД ^5,6.

Необходимы новые подходы и вмешательства для разработки терапии профилактики и лечения ХХЛД. Внутрилегочная доставка лекарств является привлекательным вмешательством для доставки лекарств в легкие и может изменить течение респираторного заболевания у новорожденных. Преимущество внутрилегочной лекарственной терапии заключается в прямой доставке активных агентов в легкие, тем самым сводя к минимуму накопление препарата в нецелевых органах ^7,8, потенциально ограничивая системные побочные эффекты. Несмотря на более чем 2 десятилетия внутрилегочной замены сурфактанта, не было валидировано никаких дополнительных внутрилегочных препаратов для улучшения респираторных исходов у новорожденных. Недавно была описана комбинированная терапия будесонидом и сурфактантом для улучшения легочных исходов после преждевременных родов у младенцев с искусственной вентиляцией легких ^9,10. Тем не менее, многое остается неизвестным о функциональных и структурных эффектах ИТ-терапии, было выявлено мало новых методов лечения, а ценность интратрахеальной доставки лекарств в неонатальном периоде остается неопределенной. Животные модели необходимы для определения потенциальных лекарств и помощи в разработке столь необходимой терапии ХХЛД.

Исследования на животных, изучающие заболевания легких у новорожденных, чаще всего проводятся на моделях мелких животных, таких как крысы и мыши 11,12,13. Кролик имеет дополнительное преимущество в виде преждевременных родов, позволяющее более точно имитировать структуру и функцию незрелого легкого человека¹⁴. Ограничением для недоношенных кроликов является трудность доступа к дыхательным путям для проведения внутрилегочных вмешательств. В то время как модели взрослых кроликов и грызунов позволяют проводить трансоральную эндотрахеальную интубацию, эти методы затруднены у новорожденных щенков из-за их небольшого размера и уникальной анатомии верхних дыхательных путей^15,16. Необходимы альтернативные подходы, чтобы обеспечить доступ к трахее для доставки лекарственных препаратов новорожденным крольчатам.

В этой рукописи мы описываем использование чрескожной игольчатой трахеостомии для интубации трахеи и доставки лекарств.

протокол

Для всех экспериментов, связанных с инъекциями ИТ, было запрошено разрешение Комитета по этике животных Лёвенского католического университета, и были соблюдены все рекомендации по благополучию и уходу за животными Лёвенского католического университета.

1. Подготовка

1. Соберите все необходимые материалы для завершения внедрения информационных технологий (Таблица 1).
2. Убедитесь, что выхлопная труба анестезирующей камеры открыта и подключена к поглотителю, чтобы предотвратить воздействие изофлурана на исследователя.

2. Доставка щенков

ПРИМЕЧАНИЕ: Детеныши кроликов (новозеландский гибрид белого и фламандского гиганта) были рождены с помощью гистеротомии на 28-й день беременности (срок 31 день) во время мешковидной фазы развития легких, как описано ранее в нашей группе¹⁷. Детенышей можно помещать либо в нормоксию для изучения развития легких после преждевременных родов, либо в гипероксию для изучения острого повреждения легких.

1. Кодам седативный с внутримышечной инъекцией 1 мл кетамина (100 мг/мл) и 1 мл ксилазина (2%) доставляется в квадрицепсы с помощью шприца объемом 2 мл и иглы 26 G. После глубокого введения седативных препаратов поместите коффердам в лежачее положение на операционном столе. Адекватная анестезия подтверждается глубоким медленным дыханием, снижением тонуса челюсти и отсутствием реакции на защемление уха.
2. Выбрейте центральную часть живота с помощью электробритвы и простерилизуйте операционное поле раствором на основе йода.
3. Усыпьте даму с помощью внутривенного болюса 1 мл T61, вводимого в боковую вену уха.
4. Немедленно выполните разрез живота по средней линии через кожу, мышечную оболочку и мышцы живота в брюшную полость.
5. Расширьте разрез, чтобы обнажить двурогую матку.
6. Немедленно сделайте разрез в матке с помощью ножниц и родите каждого из детенышей с помощью гистеротомии. Быстрая доставка щенков имеет важное значение для обеспечения выживания.
7. При родах обсушите каждого щенка бумажным полотенцем, это и сушит, и стимулирует щенка.
8. Поместите высушенного щенка в утепленный (36 °C), увлажненный (относительная влажность 50%) инкубатор.
9. Подождите 1 час для восстановления и перехода во внематочную среду. Все выжившие щенки рандомизированы в заранее определенные группы лечения.

3. Анестезия

1. Залить индукционную камеру изофлураном (2,5%, минимальная альвеолярная концентрация (ПДК) 2,5 л/мин)
2. Помещайте щенков в индукционную камеру до тех пор, пока не будет достигнут достаточный уровень анестезии (снижение спонтанного движения, снижение рефлекса стопы на болевые раздражители, снижение частоты дыхания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза детеныша кролика не открыты на 28-й день гестационного возраста (как в этом эксперименте), и, следовательно, не требуется местное применение глазной мази для предотвращения сухости роговицы. Если инъекции ИТ проводятся в более позднем возрасте, мазь топика следует наносить на открытые глаза.

4. Позиционирование для внутритрахеального введения

1. Поместите щенка на монтажную сцену, лежа на спине с вытянутой шеей, и вставьте нос в носовой конус, чтобы обеспечить непрерывную анестезию.
2. Зафиксируйте лапы щенка с помощью нерастягивающейся клейкой ленты, чтобы прикрепить лапы к монтажной площадке.
3. Определите кольца хряща трахеи и гортани, которые видны как темная подкожная структура средней линии в верхней части трахеи выше грудного входа.
4. Простерилизовать кожу над трахеей спиртовым раствором (80% раствор этанола)
5. Захватите и стабилизируйте гортань щипцами Allis недоминирующей рукой оператора.

5. Выполнение интратрахеального введения ( Рисунок 1)

1. Подготовьтесь к канюляции трахеи с помощью внутривенной канюли 26 G (лучше всего это делать доминирующей рукой), одновременно стабилизируя трахею с помощью щипцов Allis.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить стерильность процедуры, используйте новую стерильную канюлю для каждого щенка.
2. Проникните в кожу канюлей под углом 45° к коже на уровне щитовидного хряща.
3. Медленно продвигайте канюлю и стилет до тех пор, пока трахея не будет канюлирована, ощущается едва уловимый «податок», когда игла проникает в трахею и входит в просвет дыхательных путей.
4. Как только канюля со стилетом окажется в просвете трахеи, прекратите продвигаться стилета и продвигайте пластиковую канюлю над стилетом в трахею, удерживая стилет неподвижно. Не продвигайте пластиковую канюлю на >10 мм или выборочно интубируйте левый или правый главный бронх.
5. Извлеките стилет из канюли, оставив пластиковую оболочку канюли в трахее.
6. Подтвердите IT-положение канюли путем введения небольшого количества физиологического раствора (0,9% NaCl, 5 мкл) в канюлю с помощью шприца Hamilton и тупой иглы 30 G. После того, как физиологический раствор был введен в канюлю, извлеките шприц и иглу Гамильтона. Следите за уровнем воздуха и жидкости внутри пластиковой канюли; Движение уровня воздух-вода в канюле при спонтанном дыхании подтверждает размещение канюли в дыхательных путях.
7. Наберите необходимое количество вещества в шприц Гамильтона с помощью иглы с тупым концом 30 G.
8. Введите иглу с тупым наконечником 30 г (прикрепленную к шприцу Гамильтона) в пластиковую канюлю (в трахее) и медленно вводите вещество в трахею в течение 5-10 с.
9. Извлеките иглу шприца Гамильтона из пластиковой канюли, а пластиковую канюлю из трахеи.

6. Восстановление после процедуры

1. Освободите щенка от монтажной сцены и стимулируйте дыхание с помощью тактильной стимуляции щенка.
2. Верните щенка в отдельную клетку от клетки для щенков без анестезии в утепленном (36 °C), увлажненном (относительная влажность 50%) инкубаторе; Примите положение головой вверх под углом 30° до тех пор, пока он не оправится от анестезии и не сможет поддерживать лежачее положение за грудиной. Не оставляйте щенков без присмотра, пока они не оправятся от анестезии.

Результаты

Были опубликованы репрезентативные результаты методики однократных и повторных ежедневных чрескожных инъекций ИТ, которые демонстрируют, что инъекция ИТ (однократная или многократная инъекция) не влияла на выживаемость, а также не изменяла функцию или структуру ле?...

Обсуждение

Для успешного выполнения ИТ-внедрения необходимо выполнить несколько важных шагов. При правильном выполнении метод чрескожной инъекции ИТ позволяет обеспечить эффективную и надежную внутрилегочную доставку лекарств недоношенному кролику. Контроль температуры ва?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used