Vereinfachung der transkutanen intratrachealen Verabreichung von Medikamenten beim neugeborenen Kaninchen

Zusammenfassung

Die transkutane intratracheale Injektion ermöglicht eine effektive intrapulmonale Verabreichung von Medikamenten während der Spontanatmung. Einzel- und Mehrfachinjektionen werden gut vertragen, ohne Auswirkungen auf das Überleben. Die Technik ist einfach durchzuführen und kann die Wirkung von Substanzen auf die Lungenentwicklung und die Vorbeugung von Lungenverletzungen bei neugeborenen Kaninchen untersuchen.

Zusammenfassung

Die intratracheale (IT) Wirkstoffverabreichung ermöglicht die direkte Verabreichung von pharmazeutischen Substanzen an die Lunge, wodurch der potenzielle pulmonale Nutzen maximiert und die systemische Arzneimittelexposition minimiert wird. Die transkutane Technik ist einfach und ermöglicht die IT-Abgabe von Substanzen in die Lunge von Frühgeborenen kurz nach der Geburt. Neugeborene werden mit inhalativem Isofluran betäubt, bevor sie mit ausgestrecktem Hals in Rückenlage gebracht werden. Der Kehlkopf wird identifiziert und stabilisiert, bevor ein 26-Gauge-Katheter (G) transkutan in die Luftröhre eingeführt wird. Nach der Katheterisierung der Luftröhre wird eine stumpfe 30-G-Nadel, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist, in den IT-Katheter eingeführt und dient dazu, während der Spontanatmung ein präzises Volumen in die Luftröhre zu bringen. Nachdem die IT-Injektion abgeschlossen ist, werden die Nadel und der Katheter zurückgezogen, und der Welpe kann sich von der Narkose erholen. Bei der transkutanen IT-Injektion wird ein großer Teil der injizierten Substanz in die Lunge abgegeben, wobei der Großteil 3 Stunden nach dem Eingriff in der Lunge verbleibt. Die Injektionen sind ab dem Tag der Geburt gut verträglich und können an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt werden, ohne das Überleben zu beeinflussen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wirkung von pharmazeutischen Wirkstoffen auf die Lungenentwicklung und bei der Vorbeugung von Lungenverletzungen bei Neugeborenen bei Frühgeborenen zu untersuchen.

Einleitung

Die chronische neonatale Lungenerkrankung (CNLD) nach einer Frühgeburt tritt weiterhin bei einer signifikanten Anzahl von Säuglingen^{auf 1}. Eine verbesserte moderne Neugeborenenversorgung hat das Überleben signifikant erhöht und die meisten signifikanten Komplikationen nach einer Frühgeburt verringert. Während neurologische, gastrointestinale und ophthalmologische Komplikationen zurückgegangen sind, sind die respiratorischen Komplikationen in den letzten 2 Jahrzehnten weitgehend unverändert geblieben: Fast jedes zweite Kind, das vor der 28. Schwangerschaftswoche geboren wurde, entwickelt eine Lungenerkrankung.

Frühgeburten, Entzündungen, oxidative Schäden und beatmungsassoziierte Verletzungen spielen alle eine Rolle bei der Pathophysiologie der CNLD und schlechten respiratorischen Ergebnissen nach Frühgeburt ^2,3,4. Trotz der bedeutenden Fortschritte der modernen Neugeborenenversorgung steht nur eine begrenzte wirksame Therapie zur Behandlung oder Verhinderung der Entwicklung von CNLD^{zur Verfügung 5,6}.

Neue Ansätze und Interventionen sind erforderlich, um Therapien zur Prävention und Behandlung von CNLD zu entwickeln. Die intrapulmonale Verabreichung von Medikamenten ist eine attraktive Intervention, um Medikamente in die Lunge zu bringen, und könnte den Verlauf von Atemwegserkrankungen bei Neugeborenen verändern. Die intrapulmonale medikamentöse Therapie hat den Vorteil, dass die Wirkstoffe direkt in die Lunge abgegeben werden, wodurch die Akkumulation des Arzneimittels in Off-Target-Organen minimiert^{wird 7,8}, wodurch systemische Nebenwirkungen möglicherweise begrenzt werden. Trotz über 2 Jahrzehnten intrapulmonaler Tensidersatz wurden keine zusätzlichen intrapulmonalen Arzneimittel validiert, um die Ergebnisse der Atemwegserkrankungen bei Neugeborenen zu verbessern. Kürzlich wurde beschrieben, dass eine Budesonid-Tensid-Kombinationstherapie die Lungenergebnisse nach Frühgeburt bei mechanisch beatmeten Säuglingen verbessert ^9,10. Über die funktionellen und strukturellen Auswirkungen der medikamentösen IT-Therapie ist jedoch noch viel unbekannt, es wurden nur wenige neue Therapien identifiziert, und der Wert der intratrachealen Verabreichung von Medikamenten in der Neugeborenenperiode bleibt ungewiss. Tiermodelle sind erforderlich, um potenzielle Medikamente zu identifizieren und die Entwicklung dringend benötigter Therapien für CNLD zu unterstützen.

Tierstudien zur Untersuchung von Lungenerkrankungen bei Neugeborenen werden am häufigsten an Kleintiermodellen wie Ratten und Mäusen durchgeführt 11,12,13. Das Kaninchen hat den zusätzlichen Vorteil, dass es eine Frühgeburt hat, um die Struktur und Funktion der unreifen menschlichen Lunge besser nachzuahmen¹⁴. Eine Einschränkung des Frühgeborenenkaninchens ist die Schwierigkeit, Zugang zu den Atemwegen zu erhalten, um intrapulmonale Eingriffe durchführen zu können. Während erwachsene Kaninchen- und Nagetiermodelle eine transorale endotracheale Intubation ermöglichen, sind diese Techniken bei Neugeborenen aufgrund ihrer geringen Größe und der einzigartigen Anatomie der oberen Atemwege schwierig ^15,16. Alternative Ansätze sind erforderlich, um den Zugang zur Luftröhre für die Verabreichung von Medikamenten bei neugeborenen Kaninchenwelpen zu ermöglichen.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Verwendung einer transkutanen Nadeltrachealomie, um eine tracheale Intubation und Medikamentenabgabe zu ermöglichen.

Protokoll

Für alle Versuche, bei denen IT-Injektionen durchgeführt werden, wurde die Genehmigung der Tierethikkommission der KU Leuven eingeholt und alle Richtlinien zum Tierschutz und zur Tierpflege der KU Leuven wurden eingehalten.

1. Vorbereitung

1. Sammeln Sie alle erforderlichen Materialien, um die IT-Injektion abzuschließen (Tabelle 1).
2. Stellen Sie sicher, dass der Auspuff der Anästhesiekammer offen und mit einem Scavenger verbunden ist, um zu verhindern, dass der Forscher Isofluran ausgesetzt wird.

2. Lieferung von Welpen

HINWEIS: Kaninchenbabys (neuseeländischer weiß-flämischer Riesenhybrid) wurden am 28. Tag der Trächtigkeit (31. Tag) während der sackförmigen Phase der Lungenentwicklung, wie zuvor von unserer Gruppe¹⁷ beschrieben, per Hysterotomie entbunden. Welpen können entweder in Normoxie versetzt werden, um die Lungenentwicklung nach einer Frühgeburt zu untersuchen, oder in Hyperoxie, um akute Lungenschäden zu untersuchen.

1. Ruhiger Muttermund mit einer intramuskulären Injektion von 1 ml Ketamin (100 mg/ml) und 1 ml Xylazin (2%) an den Quadrizeps mit einer 2 ml-Spritze und einer 26 g Nadel. Sobald das Muttertier tief sediert ist, legen Sie es in Rückenlage auf den Operationstisch. Eine adäquate Anästhesie wird durch eine tiefe langsame Atmung, einen verminderten Kiefertonus und das Fehlen einer Reaktion auf ein eingeklemmtes Ohr bestätigt.
2. Rasieren Sie den Mittelbauch mit einem Elektrorasierer und sterilisieren Sie das Operationsfeld mit einer Lösung auf Jodbasis.
3. Euthanasieren Sie den Muttermund mit einem intravenösen Bolus von 1 ml T61, der in die Seitenvene des Ohrs verabreicht wird.
4. Führen Sie sofort einen Mittellinien-Bauchschnitt durch die Haut, die Muskelhülle und die Bauchmuskeln in die Bauchhöhle durch.
5. Verlängern Sie den Schnitt, um die zweihörnige Gebärmutter freizulegen.
6. Machen Sie sofort mit einer Schere einen Schnitt in der Gebärmutter und bringen Sie jedes der Welpen über die Hysterotomie zur Welt. Eine schnelle Lieferung der Welpen ist unerlässlich, um das Überleben zu sichern.
7. Trocknen Sie jeden Welpen bei der Lieferung mit einem Papiertuch ab, dies trocknet und stimuliert den Welpen.
8. Legen Sie den getrockneten Welpen in den erwärmten (36 °C) und befeuchteten (50 % relative Luftfeuchtigkeit) Inkubator.
9. Warten Sie 1 Stunde für die Genesung und den Übergang in die extrauterine Umgebung. Alle überlebenden Welpen werden nach dem Zufallsprinzip in die vorgegebenen Behandlungsgruppen eingeteilt.

3. Anästhesie

1. Fluten Sie die Induktionskammer mit Isofluran (2,5 %, 2,5 minimale Alveolarkonzentration (MAC), 2 l/min)
2. Legen Sie die Welpen in die Induktionskammer, bis ein angemessenes Anästhesieniveau erreicht ist (verminderte spontane Bewegung, verminderter Fußreflex auf schmerzhafte Reize, verminderte Atemfrequenz).
   HINWEIS: Die Augen des Kaninchenwelpen sind am Tag des 28. Gestationsalters nicht geöffnet (wie in diesem Experiment) und daher ist keine topische Augensalbe erforderlich, um Trockenheit der Hornhaut zu verhindern. Werden später im Leben IT-Injektionen durchgeführt, sollte eine topische Salbe auf die offenen Augen aufgetragen werden.

4. Positionierung für die intratracheale Injektion

1. Positionieren Sie das Jungtier auf der Montagestufe, in Rückenlage mit ausgestrecktem Hals und Nase in den Nasenkonus eingeführt, um eine fortgesetzte Anästhesie zu gewährleisten.
2. Fesseln Sie die Pfoten des Welpen mit nicht dehnbarem Klebeband, um die Pfoten an die Montagebühne zu kleben.
3. Identifizieren Sie die Tracheal- und Kehlkopfknorpelringe, die als dunkle subkutane Mittellinienstruktur in der oberen Luftröhre oberhalb des thorakalen Eingangs sichtbar sind.
4. Sterilisieren Sie die Haut über der Luftröhre mit Alkohollösung (80%ige Ethanollösung)
5. Fassen und stabilisieren Sie den Kehlkopf mit einer Allis-Zange mit der nicht dominanten Hand des Bedieners.

5. Durchführung der intratrachealen Injektion (Abbildung 1)

1. Bereiten Sie sich darauf vor, die Luftröhre mit der intravenösen 26-G-Kanüle zu kanülieren (am besten mit der dominanten Hand), während Sie die Luftröhre mit der Allis-Pinzette stabilisieren.
   HINWEIS: Um die Sterilität des Eingriffs zu gewährleisten, verwenden Sie für jeden Welpen eine neue sterile Kanüle.
2. Dringen Sie mit der Kanüle in einem 45°-Winkel zur Haut auf Höhe des Schilddrüsenknorpels in die Haut ein.
3. Schieben Sie die Kanüle und das Stilett langsam vor, bis die Luftröhre kanüliert ist, ein subtiles "Nachgeben" ist zu spüren, wenn die Nadel in die Luftröhre eindringt und in das Lumen der Atemwege eintritt.
4. Sobald sich die Kanüle mit dem Mandrin im Lumen der Luftröhre befindet, hören Sie auf, das Stilett vorzuschieben und schieben Sie die Kunststoffkanüle über das Stilett in die Luftröhre, während Sie das Stilett stationär halten. Schieben Sie die Kunststoffkanüle nicht >10 mm vor und es besteht keine Gefahr für eine selektive Intubation des linken oder rechten Hauptbronchus.
5. Ziehen Sie das Mandrin aus der Kanüle heraus und lassen Sie die Kanülenhülle aus Kunststoff in der Luftröhre.
6. Bestätigen Sie die IT-Position der Kanüle, indem Sie eine kleine Menge normaler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl, 5 μl) mit einer Hamilton-Spritze und einer stumpfen 30-G-Nadel in die Kanüle injizieren. Sobald die Kochsalzlösung in die Kanüle injiziert wurde, entfernen Sie die Hamilton-Spritze und die Nadel. Beobachten Sie den Luft-Flüssigkeitsstand in der Kunststoffkanüle; Die Bewegung des Luft-Wasser-Niveaus in der Kanüle mit Spontanatmung bestätigt die Platzierung der Kanüle in den Atemwegen.
7. Ziehen Sie die erforderliche Menge Substanz mit der 30-G-Nadel mit stumpfer Spitze in die Hamilton-Spritze auf.
8. Führen Sie die 30 G stumpfe Nadel (an der Hamilton-Spritze befestigt) in die Kunststoffkanüle (in der Luftröhre) ein und injizieren Sie die Substanz langsam über 5-10 s in die Luftröhre.
9. Entfernen Sie die Hamilton-Spritzennadel aus der Kunststoffkanüle und die Kunststoffkanüle aus der Luftröhre.

6. Wiederherstellung nach dem Verfahren

1. Befreien Sie den Welpen aus der Montagephase und stimulieren Sie die Atmung durch taktile Stimulation des Welpen.
2. Setzen Sie den Welpen in einen von den nicht betäubten Welpen getrennten Käfig in den erwärmten (36 °C) und befeuchteten (50 % relative Luftfeuchtigkeit) Inkubator. Platzieren Sie die Dose in einer 30°-Kopf-up-Position, bis sie sich ausreichend von der Narkose erholt hat und in der Lage ist, die sternale Liege aufrecht zu erhalten. Lassen Sie die Welpen nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich von der Narkose erholt haben.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse der Technik der einmaligen und wiederholten täglichen transkutanen IT-Injektionen wurden veröffentlicht und zeigen, dass das Überleben weder durch die IT-Injektion (Einzel- oder Mehrfachinjektionen) beeinflusst wurde, noch die IT-Injektion mit Placebo (Kochsalzlösung) die Lungenfunktion oder die Lungenstruktur im Vergleich zu den Kontrollen veränderte¹⁸.

Darüber hinaus haben wir die Technik in einer Reih...

Diskussion

Für eine erfolgreiche IT-Injektion sollten mehrere kritische Schritte befolgt werden. Bei korrekter Durchführung ermöglicht die transkutane IT-Injektionsmethode eine effektive und zuverlässige intrapulmonale Verabreichung des Arzneimittels bei Frühgeborenenkaninchen. Die Temperaturkontrolle ist wichtig, da die neugeborenen Welpen leicht unterkühlt werden, was das Überleben negativ beeinflussen kann. Bevor die Welpen in die Induktionskammer gestellt werden, sollte eine Temperaturko...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used