Simplificando a administração intratraqueal transcutânea de medicamentos no coelho recém-nascido prematuro

Resumo

A injeção intratraqueal transcutânea permite a administração intrapulmonar eficaz de medicamentos durante a respiração espontânea. Injeções únicas e múltiplas são bem toleradas sem efeito na sobrevida. A técnica é simples de executar e pode examinar o efeito de substâncias no desenvolvimento pulmonar e na prevenção de lesões pulmonares em coelhos recém-nascidos.

Resumo

A administração intratraqueal (IT) de medicamentos permite a entrega direta de substâncias farmacêuticas ao pulmão, maximizando o benefício pulmonar potencial e minimizando a exposição sistêmica a medicamentos. A técnica transcutânea é simples e permite a entrega IT de substâncias ao pulmão de coelhos nascidos prematuramente logo após o nascimento. Os filhotes recém-nascidos são anestesiados com isoflurano inalado antes de serem colocados em decúbito dorsal com o pescoço estendido. A laringe é identificada e estabilizada antes da colocação transcutânea de um cateter de calibre 26 (G) na traqueia. Após o cateterismo da traqueia, uma agulha romba de 30 G conectada a uma seringa de Hamilton é introduzida no cateter IT e é usada para fornecer um volume preciso na traqueia durante a respiração espontânea. Após a conclusão da injeção de IT, a agulha e o cateter são retirados e o filhote pode se recuperar da anestesia. A injeção transcutânea de TI fornece uma grande proporção da substância injetada ao pulmão, com a maioria permanecendo no pulmão 3 horas após a intervenção. As injeções são bem toleradas desde o dia do nascimento e podem ser repetidas por vários dias consecutivos sem influenciar a sobrevivência. Esta técnica pode ser usada para investigar o efeito de agentes farmacêuticos no desenvolvimento pulmonar e na prevenção de lesão pulmonar neonatal em coelhos prematuros.

Introdução

A doença pulmonar neonatal crônica (DCNT) após o parto prematuro continua a ocorrer em um número significativo de bebês¹. A melhoria dos cuidados neonatais modernos aumentou significativamente a sobrevida e diminuiu a maioria das complicações significativas após o parto prematuro. Embora as complicações neurológicas, gastrointestinais e oftalmológicas tenham diminuído, as complicações respiratórias permanecem praticamente inalteradas nas últimas 2 décadas, com quase um em cada dois bebês nascidos antes da 28ª semana de gestação desenvolvendo doença pulmonar.

Prematuridade, inflamação, dano oxidativo e lesão associada ao ventilador desempenham um papel na fisiopatologia da CNLD e resultados respiratórios ruins após o parto prematuro ^2,3,4. Apesar dos avanços significativos dos cuidados neonatais modernos, a terapia eficaz limitada está disponível para tratar ou prevenir o desenvolvimento de DCLD ^5,6.

Novas abordagens e intervenções são necessárias para desenvolver terapia para prevenir e tratar a CNLD. A administração intrapulmonar de medicamentos é uma intervenção atraente para administrar medicamentos ao pulmão e pode alterar o curso da doença respiratória em neonatos. A terapia medicamentosa intrapulmonar tem o benefício da entrega direta de agentes ativos ao pulmão, minimizando assim o acúmulo da droga em órgãos fora do alvo ^7,8, potencialmente limitando os efeitos colaterais sistêmicos. Apesar de mais de 2 décadas de reposição intrapulmonar de surfactante, nenhum medicamento intrapulmonar adicional foi validado para melhorar os desfechos respiratórios neonatais. Recentemente, a terapia combinada budesonida-surfactante foi descrita para melhorar os resultados pulmonares após o parto prematuro em lactentes ventilados mecanicamente ^9,10. No entanto, muito permanece desconhecido sobre os efeitos funcionais e estruturais da terapia medicamentosa IT, poucas novas terapias foram identificadas e o valor da administração intratraqueal do medicamento no período neonatal permanece incerto. Modelos animais são necessários para identificar drogas potenciais e ajudar no desenvolvimento da terapia muito necessária para CNLD.

Estudos em animais que examinam doenças pulmonares neonatais são mais comumente realizados em modelos de pequenos animais, como ratos e camundongos 11,12,13. O coelho tem a vantagem adicional do parto prematuro para imitar mais de perto a estrutura e a função do pulmão humano imaturo¹⁴. Uma limitação do coelho prematuro é a dificuldade de acesso às vias aéreas para permitir a realização de intervenções intrapulmonares. Embora os modelos adultos de coelhos e roedores permitam a intubação endotraqueal transoral, essas técnicas são difíceis em filhotes recém-nascidos devido ao seu pequeno tamanho e à anatomia única das vias aéreas superiores^15,16. Abordagens alternativas são necessárias para permitir o acesso à traqueia para a administração de medicamentos em filhotes de coelhos recém-nascidos.

Neste manuscrito, descrevemos o uso de uma traqueostomia transcutânea com agulha para permitir a intubação traqueal e a administração de medicamentos.

Protocolo

Para todos os experimentos envolvendo injeção de IT, foi solicitada permissão ao Comitê de Ética Animal da KU Leuven, e todas as diretrizes de bem-estar animal e cuidados da KU Leuven foram seguidas.

1. Preparação

1. Colete todos os materiais necessários para concluir a injeção de TI (Tabela 1).
2. Certifique-se de que a exaustão da câmara anestésica esteja aberta e conectada a um sequestrante para evitar a exposição do pesquisador ao isoflurano.

2. Entrega de filhotes

NOTA: Filhotes de coelho (híbrido gigante branco-flamengo da Nova Zelândia) nasceram por histerotomia no dia 28 de gestação (termo 31 dias) durante a fase sacular do desenvolvimento pulmonar, conforme descrito anteriormente por nosso grupo¹⁷. Os filhotes podem ser colocados em normóxia para estudar o desenvolvimento pulmonar após o parto prematuro ou hiperóxia para estudar lesão pulmonar aguda.

1. Dado com injeção intramuscular de 1 mL de cetamina (100 mg/mL) e 1 mL de xilazina (2%) administrada ao quadríceps com seringa de 2 mL e agulha 26 G. Uma vez profundamente sedado, coloque a barragem em decúbito dorsal na mesa de operação. A anestesia adequada é confirmada pela respiração lenta e profunda, diminuição do tônus da mandíbula e falta de resposta a um beliscão na orelha.
2. Depile o abdômen central com um barbeador elétrico e esterilize o campo cirúrgico com solução à base de iodo.
3. Eutanasiar a mãe com um bolus intravenoso de 1 mL de T61 administrado na veia lateral da orelha.
4. Realize imediatamente uma incisão abdominal na linha média através da pele, bainha muscular e músculos abdominais na cavidade abdominal.
5. Estenda a incisão para expor o útero bicornato.
6. Faça imediatamente uma incisão no útero usando uma tesoura e entregue cada um dos filhotes por meio da histerotomia. O parto rápido dos filhotes é essencial para garantir a sobrevivência.
7. Na entrega, seque cada filhote com uma toalha de papel, isso seca e estimula o filhote.
8. Coloque o filhote seco na incubadora aquecida (36 °C) e umidificada (50% de umidade relativa).
9. Aguarde 1 h para a recuperação e transição para o ambiente extra-uterino. Todos os filhotes sobreviventes são randomizados para os grupos de tratamento predeterminados.

3. Anestesia

1. Inunde a câmara de indução com isoflurano (2,5%, concentração alveolar mínima de 2,5 (CAM), 2 L / min)
2. Coloque os filhotes na câmara de indução até que o nível adequado de anestesia seja alcançado (diminuição do movimento espontâneo, diminuição do reflexo do pé a estímulos dolorosos, diminuição da frequência respiratória).
   NOTA: Os olhos do filhote de coelho não estão abertos no dia 28 da idade gestacional (como neste experimento) e, portanto, nenhuma pomada tópica para os olhos é necessária para evitar o ressecamento da córnea. Se as injeções de IT forem realizadas mais tarde na vida, a pomada tópica deve ser aplicada nos olhos abertos.

4. Posicionamento para injeção intratraqueal

1. Posicione o filhote no estágio de montagem, em decúbito dorsal com o pescoço estendido e o nariz inserido no nariz para fornecer anestesia contínua.
2. Contenha as patas do filhote usando fita adesiva não elástica para prender as patas no estágio de montagem.
3. Identifique os anéis de cartilagem traqueal e laríngea, que são visíveis como estrutura escura da linha média subcutânea na traqueia superior à entrada torácica.
4. Esterilize a pele sobre a traqueia com solução alcoólica (solução de etanol a 80%)
5. Segure e estabilize a laringe com uma pinça Allis com a mão não dominante do operador.

5. Realização da injeção intratraqueal ( Figura 1)

1. Prepare-se para canular a traqueia com a cânula intravenosa 26 G (melhor feita com a mão dominante) enquanto estabiliza a traqueia com a pinça Allis.
   NOTA: Para garantir a esterilidade do procedimento, use uma nova cânula estéril para cada filhote.
2. Penetre na pele com a cânula em um ângulo de 45° em relação à pele ao nível da cartilagem tireoide.
3. Avance lentamente a cânula e o estilete até que a traqueia seja canulada, uma sutil "elasticidade" é sentida quando a agulha penetra na traqueia e entra no lúmen das vias aéreas.
4. Uma vez que a cânula com o estilete esteja no lúmen da traqueia, pare de avançar o estilete e avance a cânula de plástico sobre o estilete para dentro da traqueia enquanto mantém o estilete parado. Não avance a cânula de plástico >10 mm ou intubar seletivamente o brônquio principal esquerdo ou direito é arriscado.
5. Retire o estilete da cânula, deixando a bainha da cânula de plástico na traqueia.
6. Confirme a posição IT da cânula injetando uma pequena quantidade de solução salina normal (NaCl 0,9%, 5 μL) na cânula usando uma seringa Hamilton e agulha romba 30 G. Uma vez que a solução salina tenha sido injetada na cânula, remova a seringa e a agulha de Hamilton. Observe o nível de fluido de ar dentro da cânula de plástico; O movimento do nível ar-água na cânula com respiração espontânea confirma a colocação da cânula dentro das vias aéreas.
7. Aspire a quantidade necessária de substância para a seringa Hamilton usando a agulha de ponta romba de 30 G.
8. Introduza a agulha de ponta romba de 30 G (presa à seringa Hamilton) na cânula de plástico (na traqueia) e injete lentamente a substância na traqueia ao longo de 5-10 s.
9. Remova a agulha da seringa Hamilton da cânula de plástico e a cânula de plástico da traqueia.

6. Recuperação do procedimento

1. Liberte o filhote do estágio de montagem e estimule a respiração com estimulação tátil do filhote.
2. Retorne o filhote para uma gaiola separada da gaiola dos filhotes não anestesiados na incubadora aquecida (36 °C) e umidificada (50% de umidade relativa); Coloque em uma posição de cabeça erguida de 30° até que se recupere suficientemente da anestesia e seja capaz de manter a decúbito esternal. Não deixe os filhotes sozinhos até que eles se recuperem do anestésico.

Resultados

Resultados representativos da técnica de injeções transcutâneas diárias únicas e repetidas de IT foram publicados e demonstram que a sobrevida não foi influenciada pela injeção de IT (injeções únicas ou múltiplas), nem a injeção de IT com placebo (solução salina) alterou a função pulmonar ou a estrutura pulmonar em comparação com os controles¹⁸.

Além disso, validamos a técnica em uma série de experimentos que inv...

Discussão

Várias etapas críticas devem ser seguidas para realizar a injeção de TI com sucesso. Quando realizado corretamente, o método de injeção transcutânea de IT permite a administração intrapulmonar eficaz e confiável de medicamentos no coelho prematuro. O controle da temperatura é importante, pois os filhotes recém-nascidos tornam-se facilmente hipotérmicos, o que pode influenciar negativamente a sobrevivência. Antes de colocar os filhotes na câmara de indução, o controle de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used