Semplificazione della somministrazione transcutanea di farmaci intratracheali nel coniglio pretermine neonato

Riepilogo

L'iniezione intratracheale transcutanea consente un'efficace somministrazione intrapolmonare di farmaci durante la respirazione spontanea. Le iniezioni singole e multiple sono ben tollerate e non hanno alcun effetto sulla sopravvivenza. La tecnica è semplice da eseguire e può esaminare l'effetto delle sostanze sullo sviluppo polmonare e la prevenzione del danno polmonare nei conigli appena nati.

Abstract

La somministrazione intratracheale di farmaci (IT) consente la somministrazione diretta di sostanze farmaceutiche al polmone, massimizzando il potenziale beneficio polmonare e riducendo al minimo l'esposizione sistemica ai farmaci. La tecnica transcutanea è semplice e consente la somministrazione di sostanze al polmone di conigli nati prematuramente poco dopo la nascita. I cuccioli appena nati vengono anestetizzati con isoflurano inalato prima di essere posti in posizione supina con il collo esteso. La laringe viene identificata e stabilizzata prima del posizionamento transcutaneo di un catetere calibro 26 (G) nella trachea. Dopo il cateterismo della trachea, un ago smussato da 30 G collegato a una siringa di Hamilton viene introdotto nel catetere IT e viene utilizzato per erogare un volume preciso nella trachea durante la respirazione spontanea. Al termine dell'iniezione IT, l'ago e il catetere vengono ritirati e il cucciolo può riprendersi dall'anestesia. L'iniezione transcutanea di IT eroga gran parte della sostanza iniettata al polmone, con la maggior parte che rimane nel polmone 3 ore dopo l'intervento. Le iniezioni sono ben tollerate dal giorno della nascita e possono essere ripetute per più giorni consecutivi senza influenzare la sopravvivenza. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare l'effetto degli agenti farmaceutici sullo sviluppo polmonare e nella prevenzione del danno polmonare neonatale nei conigli pretermine.

Introduzione

La malattia polmonare neonatale cronica (CNLD) a seguito di parto prematuro continua a verificarsi in un numero significativo di neonati¹. Il miglioramento delle moderne cure neonatali ha aumentato significativamente la sopravvivenza e diminuito la maggior parte delle complicanze significative dopo la nascita pretermine. Mentre le complicanze neurologiche, gastrointestinali e oftalmologiche sono diminuite, le complicanze respiratorie sono rimaste sostanzialmente invariate negli ultimi 2 decenni con quasi un bambino su due nato prima della 28a settimana di gestazione che sviluppa una malattia polmonare.

La prematurità, l'infiammazione, il danno ossidativo e le lesioni associate al ventilatore svolgono tutti un ruolo nella fisiopatologia della CNLD e negli scarsi esiti respiratori dopo la nascita pretermine ^2,3,4. Nonostante i significativi progressi delle moderne cure neonatali, è disponibile una terapia efficace limitata per trattare o prevenire lo sviluppo di CNLD ^5,6.

Sono necessari nuovi approcci e interventi per sviluppare terapie per prevenire e trattare la CNLD. La somministrazione intrapolmonare di farmaci è un intervento interessante per somministrare farmaci al polmone e potrebbe alterare il decorso della malattia respiratoria nei neonati. La terapia farmacologica intrapolmonare ha il vantaggio della somministrazione diretta di agenti attivi al polmone, riducendo così al minimo l'accumulo del farmaco negli organi fuori bersaglio ^7,8, limitando potenzialmente gli effetti collaterali sistemici. Nonostante oltre 2 decenni di sostituzione intrapolmonare del surfatturista, non sono stati convalidati ulteriori farmaci intrapolmonari per migliorare gli esiti respiratori neonatali. Recentemente, è stato descritto che la terapia di combinazione budesonide-surfattante migliora gli esiti polmonari dopo la nascita pretermine in neonati ventilati meccanicamente ^9,10. Tuttavia, molto rimane sconosciuto sugli effetti funzionali e strutturali della terapia farmacologica IT, sono state identificate poche nuove terapie e il valore della somministrazione intratracheale di farmaci nel periodo neonatale rimane incerto. I modelli animali sono necessari per identificare potenziali farmaci e aiutare lo sviluppo della terapia necessaria per la CNLD.

Gli studi sugli animali che esaminano la malattia polmonare neonatale sono più comunemente eseguiti in piccoli modelli animali come ratti e topi 11,12,13. Il coniglio ha l'ulteriore vantaggio del parto pretermine per imitare più da vicino la struttura e la funzione del polmone umano immaturo¹⁴. Un limite del coniglio pretermine è la difficoltà di accedere alle vie aeree per consentire l'erogazione di interventi intrapolmonari. Mentre i modelli adulti di coniglio e roditore consentono l'intubazione endotracheale transorale, queste tecniche sono difficili nei cuccioli appena nati a causa delle loro piccole dimensioni e dell'anatomia unica delle vie aeree superiori^15,16. Sono necessari approcci alternativi per consentire l'accesso alla trachea per la somministrazione di farmaci nei cuccioli di coniglio appena nati.

In questo manoscritto, descriviamo l'uso di una tracheostomia transcutanea con ago per consentire l'intubazione tracheale e la somministrazione di farmaci.

Protocollo

Per tutti gli esperimenti che prevedono l'iniezione di IT, è stata chiesta l'autorizzazione al Comitato Etico Animale della KU Leuven e sono state rispettate tutte le linee guida per il benessere e la cura degli animali della KU Leuven.

1. Preparazione

1. Raccogliere tutti i materiali necessari per completare l'iniezione IT (Tabella 1).
2. Assicurarsi che lo scarico della camera anestetica sia aperto e collegato a uno scavenger per evitare di esporre il ricercatore all'isoflurano.

2. Consegna dei cuccioli

NOTA: I cuccioli di coniglio (ibrido gigante bianco-fiammingo della Nuova Zelanda) sono stati partoriti tramite isterotomia il giorno 28 di gestazione (termine 31 giorni) durante la fase sacculare dello sviluppo polmonare come precedentemente descritto dal nostro gruppo¹⁷. I cuccioli possono essere sottoposti a normossia per studiare lo sviluppo polmonare dopo la nascita pretermine o iperossia per studiare il danno polmonare acuto.

1. Sedare la madre con un'iniezione intramuscolare di 1 mL di ketamina (100 mg/mL) e 1 mL di xilazina (2%) somministrata al quadricipite con una siringa da 2 mL e un ago da 26 G. Una volta sedata profondamente, posizionare la diga in posizione supina sul tavolo operatorio. Un'anestesia adeguata è confermata da una respirazione lenta e profonda, da una diminuzione del tono della mascella e dalla mancanza di risposta a un pizzicamento dell'orecchio.
2. Radere l'addome centrale con un rasoio elettrico e sterilizzare il campo chirurgico con una soluzione a base di iodio.
3. Eutanasia della madre con un bolo endovenoso di 1 mL di T61 erogato nella vena laterale dell'orecchio.
4. Eseguire immediatamente un'incisione addominale sulla linea mediana attraverso la pelle, la guaina muscolare e i muscoli addominali nella cavità addominale.
5. Estendere l'incisione per esporre l'utero bicornato.
6. Fai immediatamente un'incisione nell'utero usando un paio di forbici e fai nascere ciascuno dei cuccioli tramite l'isterotomia. La consegna rapida dei cuccioli è essenziale per garantire la sopravvivenza.
7. Al momento della consegna, asciuga ogni cucciolo con un tovagliolo di carta, questo asciuga e stimola il cucciolo.
8. Mettere il cucciolo essiccato nell'incubatrice riscaldata (36 °C) e umidificata (50% di umidità relativa).
9. Attendere 1 ora per il recupero e la transizione all'ambiente extrauterino. Tutti i cuccioli sopravvissuti sono randomizzati ai gruppi di trattamento predeterminati.

3. Anestesia

1. Inondare la camera di induzione con isoflurano (2,5%, 2,5 concentrazione alveolare minima (MAC), 2 L/min)
2. Posizionare i cuccioli nella camera di induzione fino a raggiungere un livello adeguato di anestesia (diminuzione del movimento spontaneo, diminuzione del riflesso del piede agli stimoli dolorosi, diminuzione della frequenza respiratoria).
   NOTA: Gli occhi del cucciolo di coniglio non sono aperti al 28° giorno di età gestazionale (come in questo esperimento) e, pertanto, non è necessario alcun unguento topico per prevenire la secchezza della cornea. Se le iniezioni informatiche dovessero essere eseguite più tardi nella vita, l'unguento topico dovrebbe essere applicato sugli occhi aperti.

4. Posizionamento per l'iniezione intratracheale

1. Posizionare il cucciolo sul palco di montaggio, supino con il collo esteso e il naso inserito nell'ogiva per fornire un'anestesia continua.
2. Trattenere le zampe del cucciolo usando del nastro adesivo non elastico per fissare le zampe al palco di montaggio.
3. Identificare gli anelli della cartilagine tracheale e laringea, che sono visibili come struttura scura della linea mediana sottocutanea nella trachea superiore superiore all'ingresso toracico.
4. Sterilizzare la pelle sopra la trachea con una soluzione alcolica (soluzione di etanolo all'80%)
5. Afferrare e stabilizzare la laringe con la pinza Allis con la mano non dominante dell'operatore.

5. Esecuzione dell'iniezione intratracheale (Figura 1)

1. Prepararsi a incannulare la trachea con la cannula endovenosa da 26 G (meglio farlo con la mano dominante) mentre si stabilizza la trachea con la pinza Allis.
   NOTA: Per garantire la sterilità della procedura, utilizzare una nuova cannula sterile per ogni cucciolo.
2. Penetrare la pelle con la cannula con un angolo di 45° rispetto alla pelle a livello della cartilagine tiroidea.
3. Far avanzare lentamente la cannula e lo stiletto fino a quando la trachea non è incannulata, si avverte un sottile "cedimento" quando l'ago penetra nella trachea ed entra nel lume delle vie aeree.
4. Una volta che la cannula con lo stiletto si trova nel lume della trachea, smettere di far avanzare lo stiletto e far avanzare la cannula di plastica sopra lo stiletto nella trachea tenendo fermo lo stiletto. Non far avanzare la cannula di plastica >10 mm, altrimenti si rischia di intubare selettivamente il bronco principale sinistro o destro.
5. Estrarre lo stiletto dalla cannula lasciando la guaina di plastica della cannula nella trachea.
6. Confermare la posizione IT della cannula iniettando una piccola quantità di soluzione fisiologica normale (0,9% NaCl, 5 μL) nella cannula utilizzando una siringa Hamilton e un ago smussato da 30 G. Una volta che la soluzione salina è stata iniettata nella cannula, rimuovere la siringa e l'ago di Hamilton. Osservare il livello del fluido dell'aria all'interno della cannula di plastica; Il movimento del livello aria-acqua nella cannula con la respirazione spontanea conferma il posizionamento della cannula all'interno delle vie aeree.
7. Aspirare la quantità necessaria di sostanza nella siringa Hamilton utilizzando l'ago a punta smussata da 30 G.
8. Introdurre l'ago con punta smussata da 30 G (collegato alla siringa di Hamilton) nella cannula di plastica (nella trachea) e iniettare lentamente la sostanza nella trachea in 5-10 s.
9. Rimuovere l'ago della siringa di Hamilton dalla cannula di plastica e la cannula di plastica dalla trachea.

6. Recupero dalla procedura

1. Libera il cucciolo dalla fase di montaggio e stimola la respirazione con la stimolazione tattile del cucciolo.
2. Rimettere il cucciolo in una gabbia separata dalla gabbia per cuccioli non anestetizzata nell'incubatrice riscaldata (36 °C) e umidificata (50% di umidità relativa); Posizionare in una posizione di 30° a testa in su fino a quando non si sarà sufficientemente ripresi dall'anestesia e in grado di mantenere la decubito sternale. Non lasciare i cuccioli incustoditi fino a quando non si riprendono dall'anestesia.

Risultati

I risultati rappresentativi della tecnica di iniezioni transcutanee giornaliere singole e ripetute di IT sono stati pubblicati e dimostrano che la sopravvivenza non è stata influenzata dall'iniezione di IT (iniezioni singole o multiple), né l'iniezione di IT con placebo (soluzione fisiologica) ha alterato la funzione polmonare o la struttura polmonare rispetto ai controlli¹⁸.

Inoltre, abbiamo convalidato la tecnica in una serie di esp...

Discussione

È necessario seguire diversi passaggi critici per eseguire correttamente l'iniezione IT. Se eseguito correttamente, il metodo di iniezione transcutanea IT consente una somministrazione intrapolmonare efficace e affidabile del farmaco nel coniglio pretermine. Il controllo della temperatura è importante poiché i cuccioli appena nati diventano facilmente ipotermici, il che può influenzare negativamente la sopravvivenza. Prima di posizionare i cuccioli nella camera di induzione, è neces...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used