新生児早産ウサギにおける経皮的気管内薬物送達の簡素化

要約

経皮的気管内注射は、自発呼吸中に効果的な肺内薬物送達を可能にします。単回注射と複数回注射は忍容性が高く、生存率に影響を与えません。この技術は簡単に実行でき、新生ウサギの肺の発達と肺損傷の予防に対する物質の影響を調べることができます。

要約

気管内(IT)薬物送達は、医薬品を肺に直接送達することを可能にし、潜在的な肺の利点を最大化し、全身の薬物曝露を最小限に抑えます。経皮的技術は簡単で、出生直後に早産のウサギの肺に物質をITで送達することができます。新生児の子犬は、首を伸ばして仰臥位に置かれる前に、吸入されたイソフルランで麻酔されます。喉頭は、26 ゲージ (G) カテーテルを気管に経皮的に留置する前に、特定され、安定化されます。気管のカテーテル挿入後、ハミルトンシリンジに取り付けられた30Gの鈍い針がITカテーテルに導入され、自発呼吸中に気管に正確な量を送達するために使用されます。IT注射が完了したら、針とカテーテルを抜いて、子犬を麻酔から回復させます。経皮的IT注射は、注入された物質の大部分を肺に送達し、介入後3時間で大多数が肺に残ります。注射は出生日から忍容性が高く、生存に影響を与えることなく、数日間連続して繰り返すことができます。この技術は、早産ウサギの肺の発達や新生児の肺損傷の予防に対する医薬品の影響を調査するために使用できます。

概要

早産後の慢性新生児肺疾患(CNLD)は、かなりの数の乳児に発生し続けています¹。現代の新生児ケアの改善により、生存率が大幅に向上し、早産後の重大な合併症の大部分が減少しました。神経学的、胃腸内、眼科的な合併症は減少していますが、呼吸器系の合併症は過去20年間でほとんど変化せず、妊娠28週未満で生まれた乳児のほぼ2人に1人が肺疾患を発症しています。

未熟児、炎症、酸化的損傷、および人工呼吸器関連の損傷はすべて、CNLDの病態生理学と早産後の呼吸器転帰不良に関与しています^2,3,4。現代の新生児医療の大幅な進歩にもかかわらず、CNLDの発症を治療または予防するための効果的な治療法は限られています^5,6。

CNLDを予防および治療するための治療法を開発するには、新しいアプローチと介入が必要です。肺内薬物送達は、薬物を肺に送達するための魅力的な介入であり、新生児の呼吸器疾患の経過を変える可能性があります。肺内薬物療法には、活性物質が肺に直接送達されるという利点があり、それにより、標的外臓器への薬物の蓄積を最小限に抑え、全身性の副作用を制限する可能性があります^7,8。20年以上にわたる肺内サーファクタントの補充にもかかわらず、新生児の呼吸器転帰を改善するための追加の肺内薬は検証されていません。最近、ブデソニドとサーファクタントの併用療法は、人工呼吸器を装着した乳児の早産後の肺の転帰を改善することが説明されています^9,10。しかし、IT薬物療法の機能的および構造的影響については不明な点が多く、新しい治療法はほとんど特定されておらず、新生児期における気管内薬物送達の価値は依然として不明です。動物モデルは、潜在的な薬剤を特定し、CNLDに非常に必要な治療法の開発を支援するために必要です。

新生児肺疾患を調べる動物実験は、ラットやマウスなどの小動物モデルで最も一般的に行われています11,12,13。ウサギは、未熟なヒト肺の構造および機能をより密接に模倣するための早産という追加の利点を有する¹⁴。早産ウサギの限界は、肺内インターベンションの実施を可能にするために気道にアクセスするのが難しいことです。成体のウサギとげっ歯類のモデルでは、経口気管内挿管が可能ですが、これらの技術は、サイズが小さく、上気道の独特な解剖学的構造のために、新生児の子犬では困難です^15,16。新生児のウサギの子犬に薬物を送達するための気管へのアクセスを可能にするには、代替のアプローチが必要です。

この原稿では、気管挿管と薬物送達を可能にするための経皮的針気管切開の使用について説明します。

プロトコル

ITインジェクションを含むすべての実験については、ルーヴェン・カトリック大学の動物倫理委員会に許可を求め、ルーヴェン・カトリック大学の動物福祉とケアに関するすべてのガイドラインが遵守されました。

1. 事前準備

1. ITインジェクションを完了するために必要なすべての材料を収集します(表1)。
2. 麻酔チャンバーの排気が開いており、研究者がイソフルランにさらされるのを防ぐためにスカベンジャーに接続されていることを確認してください。

2.子犬の出産

注:ウサギの子犬(ニュージーランドの白とフランドルの巨大雑種)は、私たちのグループ¹⁷によって以前に説明されたように、肺の発達の嚢状段階で妊娠28日目(学期31日)に子宮切開術によって分娩されました。子犬は、早産後の肺の発達を研究するために正常酸素症に配置するか、急性肺損傷を研究するために高酸素症のいずれかに配置することができます。

1. 1 mL ケタミン (100 mg/mL) と 1 mL キシラジン (2%) の筋肉内注射を 2 mL シリンジと 26 G 針で大腿四頭筋に送達した鎮静ダム。深く鎮静したら、ダムを手術台の仰向けの位置に置きます。適切な麻酔は、深いゆっくりとした呼吸、顎の緊張の低下、および耳のつまみに対する反応の欠如によって確認されます。
2. 電気シェーバーで腹部の中央部を剃り、ヨウ素ベースの溶液で手術野を滅菌します。
3. 耳の外側静脈に送達された 1 mL の T61 の静脈内ボーラスで母を安楽死させます。
4. すぐに、皮膚、筋肉鞘、腹筋を通って腹腔内に正中線腹切開を行います。
5. 切開部を伸ばして、両角の子宮を露出させます。
6. すぐにハサミを使用して子宮を切開し、子宮切開術で各子犬を出産します。子犬の迅速な出産は、生存を確保するために不可欠です。
7. 配達時には、ペーパータオルを使用して各子犬を乾かし、これにより子犬が乾いて刺激されます。
8. 乾燥させた子犬を、温めた(36°C)加湿した(相対湿度50%)インキュベーターに入れます。
9. 回復と子宮外環境への移行に1時間かかります。生き残ったすべての子犬は、所定の治療群に無作為に割り付けられます。

3.麻酔

1. 誘導チャンバーにイソフルラン(2.5%、2.5最小肺胞濃度(MAC)、2 L / min)を浸水させます
2. 適切なレベルの麻酔が達成されるまで、子犬を誘導室に入れます(自発的な動きの減少、痛みを伴う刺激に対する足の反射の減少、呼吸数の減少)。
   注:ウサギの子犬の目は妊娠28日目に開いていないため(この実験のように)、角膜の乾燥を防ぐために局所眼軟膏は必要ありません。IT注射が後年行われる場合は、開いた目に局所軟膏を塗布する必要があります。

4. 気管内注射のポジショニング

1. 子犬をマウントステージに置き、首を伸ばして仰臥位にし、鼻をノーズコーンに挿入して、継続的な麻酔を提供します。
2. 伸びない粘着テープを使用して子犬の足を拘束し、足を取り付けステージにテープで固定します。
3. 胸部入口よりも上の上部気管の暗い皮下正中線構造として見える気管および喉頭軟骨輪を特定します。
4. 気管の上の皮膚をアルコール溶液(80%エタノール溶液)で滅菌します。
5. オペレーターの利き手ではない手で、アリス鉗子で喉頭をつかんで安定させます。

5. 気管内注射の実施(図1)

1. 26 Gの静脈内カニューレ(利き手で行うのが最適です)で気管をカニューレする準備をし、アリス鉗子で気管を安定させます。
   注:手順の無菌性を確保するために、各子犬に新しい滅菌カニューレを使用してください。
2. カニューレで、甲状軟骨のレベルで皮膚に対して45°の角度で皮膚を貫通します。
3. 気管がカニューレ挿入されるまでカニューレとスタイレットをゆっくりと進め、針が気管を貫通して気道内腔に入るときに微妙な「ギブ」が感じられます。
4. スタイレット付きのカニューレが気管の内腔に入ったら、スタイレットの前進を止め、スタイレットを静止させたままプラスチックカニューレをスタイレットの上から気管に進めます。プラスチック製のカニューレを10 mm>進めたり、左右の主気管支を選択的に挿管したりするリスクがあります。.
5. プラスチック製のカニューレシースを気管に残して、カニューレからスタイレットを引き出します。
6. ハミルトンシリンジと30Gの鈍い針を使用して、少量の生理食塩水(0.9%NaCl、5μL)をカニューレに注入することにより、カニューレのIT位置を確認します。生理食塩水がカニューレに注入されたら、ハミルトンシリンジと針を取り外します。プラスチックカニューレ内の空気液のレベルを観察します。自発呼吸によるカニューレ内の空気水位の動きは、気道内のカニューレの配置を確認します。
7. 30 Gの鈍い先端針を使用して、必要な量の物質をハミルトンシリンジに吸い込みます。.
8. 30 Gの先端が鈍い針(ハミルトンシリンジに取り付けられています)をプラスチック製のカニューレ(気管内)に導入し、物質を5〜10秒かけてゆっくりと気管に注入します。
9. ハミルトンシリンジ針をプラスチックカニューレから取り外し、プラスチックカニューレを気管から取り外します。

6. 手続きからの回復

1. 子犬をマウントステージから解放し、子犬の触覚刺激で呼吸を刺激します。
2. 子犬を、加温(36°C)、加湿(相対湿度50%)のインキュベーター内の麻酔されていない子犬ケージとは別のケージに戻します。麻酔から十分に回復し、胸骨の横臥を維持できるようになるまで、30°のヘッドアップポジションに置きます。子犬が麻酔薬から回復するまで、子犬を放置しないでください。

結果

1 回および 1 回および 1 回の経皮的 IT 注射の手法の代表的な結果が発表されており、生存率は IT 注射 (1 回または複数回の注射) の影響を受けず、プラセボ (生理食塩水) による IT 注射は対照と比較して肺機能または肺構造を変化させなかったことを示しています¹⁸。

さらに、放射性トレーサー (2-デオキシ-2-[18F]フルオロ-D-グル?...

ディスカッション

ITインジェクションを正常に実行するには、いくつかの重要な手順に従う必要があります。経皮的IT注射法は、正しく実施されれば、早産ウサギにおける効果的かつ信頼性の高い肺内薬物送達を可能にします。新生児の子犬は低体温になりやすく、生存に悪影響を与える可能性があるため、温度制御は重要です。子犬を誘導チャンバーに入れる前に、常温状態を維持?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used