Simplificación de la administración transcutánea de fármacos intratraqueales en el conejo prematuro recién nacido

Resumen

La inyección intratraqueal transcutánea permite una administración intrapulmonar eficaz del fármaco durante la respiración espontánea. Las inyecciones únicas y múltiples son bien toleradas sin ningún efecto sobre la supervivencia. La técnica es sencilla de realizar y puede examinar el efecto de las sustancias en el desarrollo pulmonar y la prevención de lesiones pulmonares en conejos recién nacidos.

Resumen

La administración intratraqueal (IT) de fármacos permite la administración directa de sustancias farmacéuticas al pulmón, lo que maximiza el beneficio pulmonar potencial y minimiza la exposición sistémica a fármacos. La técnica transcutánea es sencilla y permite la entrega de sustancias al pulmón de conejos nacidos prematuramente poco después de su nacimiento. Las crías recién nacidas son anestesiadas con isoflurano inhalado antes de ser colocadas en posición supina con el cuello extendido. La laringe se identifica y estabiliza antes de la colocación transcutánea de un catéter de calibre 26 (G) en la tráquea. Después del cateterismo de la tráquea, se introduce en el catéter IT una aguja roma de 30 G unida a una jeringa Hamilton y se utiliza para administrar un volumen preciso en la tráquea durante la respiración espontánea. Una vez completada la inyección IT, se retiran la aguja y el catéter, y se permite que el cachorro se recupere de la anestesia. La inyección intrauterina transcutánea administra una gran proporción de la sustancia inyectada al pulmón, y la mayor parte permanece en el pulmón 3 horas después de la intervención. Las inyecciones son bien toleradas desde el día del nacimiento y pueden repetirse durante varios días consecutivos sin influir en la supervivencia. Esta técnica se puede utilizar para investigar el efecto de los agentes farmacéuticos en el desarrollo pulmonar y en la prevención de la lesión pulmonar neonatal en conejos prematuros.

Introducción

La enfermedad pulmonar neonatal crónica (ECN) después de un parto prematuro continúa ocurriendo en un número significativo de lactantes¹. La mejora de la atención neonatal moderna ha aumentado significativamente la supervivencia y ha disminuido la mayoría de las complicaciones importantes después del parto prematuro. Si bien las complicaciones neurológicas, gastrointestinales y oftalmológicas han disminuido, las complicaciones respiratorias permanecen prácticamente sin cambios en las últimas 2 décadas, y casi uno de cada dos bebés nacidos antes de las 28 semanas de gestación desarrolla enfermedad pulmonar.

La prematuridad, la inflamación, el daño oxidativo y las lesiones asociadas al ventilador desempeñan un papel en la fisiopatología de la CNLD y en los malos resultados respiratorios después del parto prematuro ^2,3,4. A pesar de los avances significativos de la atención neonatal moderna, la terapia efectiva disponible para tratar o prevenir el desarrollo de CNLD ^5,6 es limitada.

Se requieren nuevos enfoques e intervenciones para desarrollar terapias que prevengan y traten la CNLD. La administración intrapulmonar de fármacos es una intervención atractiva para administrar fármacos al pulmón y podría alterar el curso de la enfermedad respiratoria en los neonatos. El tratamiento farmacológico intrapulmonar tiene el beneficio de la administración directa de agentes activos al pulmón, minimizando así la acumulación del fármaco en órganos fuera del objetivo ^7,8, lo que puede limitar los efectos secundarios sistémicos. A pesar de más de 2 décadas de reemplazo de surfactante intrapulmonar, no se han validado fármacos intrapulmonares adicionales para mejorar los resultados respiratorios neonatales. Recientemente, se ha descrito que la terapia combinada con budesonida-surfactante mejora los resultados pulmonares después del parto prematuro en lactantes con ventilación mecánica ^9,10. Sin embargo, aún se desconoce mucho sobre los efectos funcionales y estructurales de la terapia con fármacos IT, se han identificado pocas terapias nuevas y el valor de la administración intratraqueal de fármacos en el período neonatal sigue siendo incierto. Se requieren modelos animales para identificar fármacos potenciales y ayudar al desarrollo de una terapia muy necesaria para la CNLD.

Los estudios en animales que examinan la enfermedad pulmonar del recién nacido se realizan con mayor frecuencia en modelos animales pequeños como ratas y ratones 11,12,13. El conejo tiene la ventaja adicional del parto prematuro para imitar más de cerca la estructura y función del pulmón humano inmaduro¹⁴. Una limitación del conejo prematuro es la dificultad de acceder a la vía aérea para permitir la realización de intervenciones intrapulmonares. Mientras que los modelos de conejos y roedores adultos permiten la intubación endotraqueal transoral, estas técnicas son difíciles en las crías recién nacidas debido a su pequeño tamaño y a la anatomía única de la vía aérea superior^15,16. Se requieren enfoques alternativos para permitir el acceso a la tráquea para la administración de medicamentos en cachorros de conejo recién nacidos.

En este manuscrito, describimos el uso de una traqueostomía transcutánea con aguja para permitir la intubación traqueal y la administración del fármaco.

Protocolo

Para todos los experimentos que involucran la inyección de IT, se ha solicitado el permiso del Comité de Ética Animal de KU Leuven, y se han seguido todas las pautas de bienestar animal y cuidado de KU Leuven.

1. Preparación

1. Reúna todos los materiales necesarios para completar la inyección de IT (Tabla 1).
2. Asegúrese de que el escape de la cámara anestésica esté abierto y conectado a un eliminador para evitar exponer al investigador al isoflurano.

2. Entrega de cachorros

NOTA: Las crías de conejo (híbrido blanco-gigante flamenco de Nueva Zelanda) nacieron mediante histerostomía en el día 28 de gestación (término 31 días) durante la fase sacular del desarrollo pulmonar como se describió previamente en nuestro grupo¹⁷. Las crías se pueden colocar en normoxia para estudiar el desarrollo pulmonar después de un parto prematuro o hiperoxia para estudiar la lesión pulmonar aguda.

1. Barrera de sedación con una inyección intramuscular de 1 mL de ketamina (100 mg/mL) y 1 mL de xilacina (2%) administrada al cuádriceps con una jeringa de 2 mL y una aguja de 26 G. Una vez profundamente sedado, coloque la madre en posición supina sobre la mesa de operaciones. La anestesia adecuada se confirma mediante una respiración profunda y lenta, disminución del tono de la mandíbula y falta de respuesta a un pellizco en el oído.
2. Afeitar la parte central del abdomen con una afeitadora eléctrica y esterilizar el campo quirúrgico con una solución a base de yodo.
3. Eutanasiar el matón con un bolo intravenoso de 1 mL de T61 administrado en la vena lateral del oído.
4. Realice inmediatamente una incisión en la línea media del abdomen a través de la piel, la vaina muscular y los músculos abdominales hasta la cavidad abdominal.
5. Extienda la incisión para exponer el útero bicornado.
6. Inmediatamente haga una incisión en el útero con un par de tijeras y libere a cada una de las crías a través de la histerotomía. La entrega rápida de las crías es esencial para garantizar la supervivencia.
7. En el momento de la entrega, seque cada cachorro con una toalla de papel, esto seca y estimula al cachorro.
8. Coloque el cachorro seco en la incubadora calentada (36 °C) y humidificada (50% de humedad relativa).
9. Espere 1 h para la recuperación y la transición al entorno extrauterino. Todos los cachorros supervivientes se asignan al azar a los grupos de tratamiento predeterminados.

3. Anestesia

1. Inundar la cámara de inducción con isoflurano (2,5%, concentración alveolar mínima (MAC) de 2,5, 2 L/min)
2. Coloque a los cachorros en la cámara de inducción hasta que se logre un nivel adecuado de anestesia (disminución del movimiento espontáneo, disminución del reflejo del pie a estímulos dolorosos, disminución de la frecuencia respiratoria).
   NOTA: Los ojos del cachorro de conejo no están abiertos el día 28 de edad gestacional (como en este experimento) y, por lo tanto, no se requiere ungüento tópico para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea. En caso de que las inyecciones de IT se realicen más adelante en la vida, se debe aplicar un ungüento tópico en los ojos abiertos.

4. Posicionamiento para inyección intratraqueal

1. Coloque al cachorro en la etapa de montaje, en decúbito supino con el cuello extendido y la nariz insertada en la nariz para proporcionar anestesia continua.
2. Sujete las patas del cachorro con cinta adhesiva no elástica para pegar las patas a la etapa de montaje.
3. Identificar los anillos de cartílago traqueal y laríngeo, que son visibles como una estructura oscura de la línea media subcutánea en la tráquea superior superior a la entrada torácica.
4. Esterilizar la piel sobre la tráquea con una solución de alcohol (solución de etanol al 80%)
5. Agarre y estabilice la laringe con pinzas Allis con la mano no dominante del operador.

5. Realización de la inyección intratraqueal (Figura 1)

1. Prepárese para canular la tráquea con la cánula intravenosa de 26 G (es mejor hacerlo con la mano dominante) mientras estabiliza la tráquea con las pinzas de Allis.
   NOTA: Para garantizar la esterilidad del procedimiento, utilice una nueva cánula estéril para cada cachorro.
2. Penetrar en la piel con la cánula en un ángulo de 45° con respecto a la piel a nivel del cartílago tiroides.
3. Avance lentamente la cánula y el estilete hasta que la tráquea esté canulada, se siente un sutil "ceder" a medida que la aguja penetra en la tráquea y entra en la luz de las vías respiratorias.
4. Una vez que la cánula con el estilete esté en la luz de la tráquea, deje de avanzar el estilete y avance la cánula de plástico sobre el estilete hacia la tráquea mientras mantiene el estilete inmóvil. No avance la cánula de plástico >10 mm o se corre el riesgo de intubar selectivamente el bronquio principal izquierdo o derecho.
5. Retire el estilete de la cánula dejando la vaina de plástico de la cánula en la tráquea.
6. Confirme la posición IT de la cánula inyectando una pequeña cantidad de solución salina normal (NaCl al 0,9 %, 5 μL) en la cánula con una jeringa Hamilton y una aguja roma de 30 G. Una vez que se haya inyectado la solución salina en la cánula, retire la jeringa Hamilton y la aguja. Observe el nivel de aire y líquido dentro de la cánula de plástico; El movimiento del nivel aire-agua en la cánula con respiración espontánea confirma la colocación de la cánula dentro de la vía aérea.
7. Extraiga la cantidad necesaria de sustancia en la jeringa Hamilton con la aguja de punta roma de 30 G.
8. Introduzca la aguja de punta roma de 30 G (unida a la jeringa Hamilton) en la cánula de plástico (en la tráquea) e inyecte lentamente la sustancia en la tráquea durante 5-10 s.
9. Retire la aguja de la jeringa Hamilton de la cánula de plástico y la cánula de plástico de la tráquea.

6. Recuperación del procedimiento

1. Libere al cachorro de la etapa de montaje y estimule la respiración con la estimulación táctil del cachorro.
2. Regrese el cachorro a una jaula separada de la jaula de cachorros sin anestesiar en la incubadora calentada (36 °C) y humidificada (50% de humedad relativa); Colóquelo en una posición de 30° con la cabeza hacia arriba hasta que se recupere lo suficiente de la anestesia y pueda mantener la decúbito esternal. No deje a los cachorros desatendidos hasta que se recuperen de la anestesia.

Resultados

Se han publicado resultados representativos de la técnica de inyecciones transcutáneas de IT únicas y repetidas diarias, que demuestran que la supervivencia no se vio influida por la inyección de IT (inyecciones únicas o múltiples), ni la inyección de IT con placebo (solución salina) alteró la función pulmonar o la estructura pulmonar en comparación con los controles¹⁸.

Además, hemos validado la técnica en una serie de expe...

Discusión

Se deben seguir varios pasos críticos para realizar con éxito la inyección de TI. Cuando se realiza correctamente, el método de inyección intrapulmonar transcutánea permite una administración intrapulmonar eficaz y fiable del fármaco en el conejo prematuro. El control de la temperatura es importante ya que las crías recién nacidas se vuelven fácilmente hipotérmicas, lo que puede influir negativamente en la supervivencia. Antes de colocar las crías en la cámara de inducción...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Heating matt to prevent cooling during anesthesia			1
Isoflurane vaporizer with oxygen supply			1
Isoflurane (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, Belgium		2% at 2 liters/minute
Plexiglas induction chamber with exhaust and scavenger	In house built		1
Positioning for injection
Mounting stage	In-house built (made out of styrofoam to allow flexible positioning		1
Nose cone connected to anesthetic circuit			1
Scavenger system			1
Tape to restrain limbs	Any		1 roll
Intratracheal injection
Allis tissue forceps			1
19-mm-long 26-gauge catheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton syringe (10µl with 20 mm blunt 30-gauge needle	Hamilton Company	7638-01	1
Pharmaceutical substance of choice			as per protocol
Saline (0.9% NaCl)			5 µl per animal
Animal housing
Humidity- and temperature-controlled incubator	Okolab Srl. Custom built cage incubator. Alternatively, in-house built cage incubators can be used