激光捕获手术组织显微解剖以识别 2 型糖尿病伤口愈合受损中的异常基因表达

摘要

该技术为使用临床相关的人体组织对糖尿病伤口进行离 体 伤口、进行激光捕获显微解剖和量化与伤口愈合过程不良相关的基因表达变化提供了指南。

摘要

全球 2 型糖尿病 （T2DM） 的患病率正在迅速上升。T2DM 患者患有多种并发症，其中之一是伤口愈合受损。这可能导致无法愈合的疮或足部溃疡的发展，并最终导致截肢。在健康个体中，伤口愈合遵循受控和重叠的事件序列，包括炎症、增殖和重塑。在 T2DM 中，这些步骤中的一个或多个变得功能失调。目前研究 T2DM 伤口愈合受损的模型包括体外划痕伤口测定、皮肤等效物或动物模型，以检查支持伤口愈合的分子机制和/或潜在的治疗选择。然而，这些并不能完全概括 T2DM 患者复杂的伤口愈合过程，并且 离体 人体皮肤测试是有问题的，因为在已知患者愈合不佳的情况下对患者进行穿刺活检的伦理问题。在这里，描述了一种技术，该技术可以使用截肢或择期整容手术后丢弃的剩余组织来检查参与 T2DM 患者（不良）功能伤口愈合反应的特定细胞的表达谱。在该方案中，收集捐赠皮肤的样品，受伤，在气液界面 中离体 培养，在不同时间点固定并切片。使用激光捕获显微切割分离参与伤口愈合的特定细胞类型（例如，表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞（状和网状）、脉管系统）并通过测序或微阵列分析基因表达的差异，并通过 qPCR 进一步验证感兴趣的基因。该方案可用于识别糖尿病患者或非糖尿病患者愈合不良和完整皮肤之间基因表达的固有差异，使用通常在手术后丢弃的组织。它将更好地了解导致 T2DM 慢性伤口和下肢丧失的分子机制。

引言

在肥胖流行和缺乏身体活动的推动下，2 型糖尿病的发病率在全球范围内不断增长。伤口愈合不良在这些患者中很常见，高达 25% 的患者会出现慢性不愈合伤口¹。支撑这种情况的机制复杂且不完全清楚，限制了新疗法的发现率。造成这种情况的因素之一是缺乏合适的模型来研究 2 型糖尿病患者的伤口愈合。因此，该方法的目的是提供一个生理学相关的 离体 模型，用于检查有慢性伤口风险的人的伤口愈合情况，允许转录组学分析以推进新治疗靶点的确定。

目前有多种模型可用于研究伤口愈合，每种模型都有其优点和缺点。体内动物模型，如 db/db 小鼠² 或链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠³ 被广泛使用;然而，啮齿动物模型中的伤口通过收缩愈合，这与人体采用的机制非常不同，并且在转化为临床试验方面的成功有限 ^4,5。使用人体组织的好处已得到公认⁴，但由于对已知伤口愈合反应受损的个体造成实验性伤口的伦理问题而变得复杂。因此，对人类糖尿病患者的研究更常针对炎症反应，而不是在切除的组织上进行实验⁶。还提供器官芯片 7 （Organ-on-a-chip⁷） 和人工皮肤模型⁸ （artificial skin models）。这些方法的好处是能够分析人类细胞的贡献，但几乎不能说明患者间的差异性。因此，研究弱势患者群体伤口愈合进展的临床相关模型可以加速该领域的机制理解和药物发现。

下面描述的 离体 伤害方案改编自 Stojadinovic 和 Tomic-Canic，2013⁹。它适用于检查体外人体 组织样本受控 损伤的转录数据，并可应用于伤口愈合不良患者（例如 2 型糖尿病、老年人）的临床样本，以增进有关伤口愈合在这些情况下如何影响伤口愈合以及可能如何恢复的知识。

研究方案

该协议依赖于人类手术组织的提供。在实验之前获得了伦理批准和患者知情同意，该研究符合赫尔辛基宣言中概述的原则。

1. 组织收集和 离体 创伤

1. 将肢体截肢/手术后的手术组织收集到含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的无菌容器中，其中含有 5% 青霉素-链霉素-真菌zone、2 mM L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS;完全生长培养基）。
   注意：以这种方式收集的组织可以在实验前在 4 °C 下储存长达 24 小时。为确保组织在 离体 实验中的活力，建议尽快处理组织或在收集和受伤之间保持固定的时间间隔，以标准化多次组织捐献的实验。如果要将组织储存任意时间，则应向样品中添加 RNA 稳定溶液以保持 RNA 完整性。
2. 使用无菌镊子，将组织转移到一个 60 毫米培养皿中，该培养皿中装有补充有 5% 青霉素-链霉素-真菌区的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。使用无菌手术刀和/或手术剪刀修剪真皮上的脂肪并丢弃。将组织转移到装有无菌 PBS 的新鲜培养皿中。
3. 将两个无菌刀片连接在一起，使两个刀片之间有 1 mm 的间隙。在表皮长度和状真皮上部划出两条平行的线性线，相距 ~1 毫米 ^10,11。
4. 使用无菌镊子和手术剪刀去除划痕线之间的表皮，形成线性伤口。
5. 用手术刀将组织切成小矩形（最大尺寸为 1 cm²），包围伤口，两侧有完整的表皮。
   注：为了保持组织和后续 RNA 的完整性，应尽快执行步骤 1.2-1.5。
6. 使用显微解剖显微镜以 4 倍放大倍率拍摄受伤组织的图像，确保视野捕捉到整个伤口和周围完整的表皮组织。
7. 使用无菌镊子，将组织矩形放在 6 孔板中的组织培养插入物上，然后轻轻地将 2 mL 完全生长培养基移入孔中。这将确保样品在液-气界面培养。
8. 在 37 °C 下在 5% CO₂ 空气中孵育长达 120 小时。
   注意：组织应在显微解剖显微镜上以与孵育结束时步骤 1.6 相同的放大倍率成像。如有必要，也可以每 24 小时拍摄一次图像。

2. 组织固定和冷冻切片

1. 在液氮中快速冷冻组织。将少量与低温恒温器兼容的切割介质放在低温恒温器卡盘上，并将组织嵌入其中。将组织垂直于卡盘的方向，以便切割面切穿皮肤的所有层，包括受伤区域。储存在 -80 °C。
   注意：协议可以在此处暂停。
2. 在室温下用 70% 乙醇和 RNase 去污喷雾清洁低温恒温器。将低温恒温器温度设置为 -28 °C。
3. 检查卡盘和低温恒温器刀片的方向是否可以产生包含组织整个厚度的切片，包括受伤组织和下面的真皮。
4. 使用低温恒温器，从每个伤口上切下多达 10 个 7 μm 切片，并放在无 RNA 的显微切割载玻片上。
5. 将载玻片储存在-80°C下提供显微解剖载玻片的原始盒子中，以确保无RNase的环境。
   注意：该方案可以在此处暂停，但请注意，储存时间越长，RNA 降解就越严重。

3. 激光捕获显微切割

1. 将带有组织切片的显微解剖载玻片放入干冰中，然后转到激光捕获显微解剖显微镜室。
2. 风干^{第 1 张} 载玻片，并在进行激光捕获显微切割之前，立即使用不含 RNase 的苏木精和伊红染色试剂盒用苏木精对切片进行染色。
3. 使用激光捕获显微解剖显微镜以 10 倍放大倍率观察受伤组织，并拍摄将要激光捕获的感兴趣区域的照片。
4. 追踪该区域（例如，上皮舌、肉芽组织、微血管）并使用正在使用的特定显微镜的软件说明收集到显微解剖 0.5 mL 扩散器隔离帽中。
5. 使用激光捕获显微解剖显微镜以 10 倍放大倍率重新可视化和成像激光捕获的感兴趣区域，以演示解剖组织的位置和完全切除。
   注：对每个样品（最多 10 个切片）进行激光捕获，最长时间为 1 小时，以尽量减少 RNA 降解。
6. 根据制造商的说明，将 RNA 储存缓冲液添加到含有显微解剖组织的试管中，并储存在干冰中，直到可以转移到 -80^°C 冰箱中。
   注意：该协议可以在此处暂时暂停。

4. 差异基因表达的定量

1. 全速离心样品管 1 分钟。
2. 按照制造商的说明从显微解剖组织中分离 RNA。
3. 根据制造商的说明，在最终体积为 12 μL 的不含 RNase 的水中洗脱 RNA，并使用 RNA 扩增试剂盒和热循环仪扩增 RNA。建议进行两轮扩增，以确保有足够的 RNA 用于进一步分析。使用 表 1 中的扩增条件。

第一轮扩增			第二轮扩增
第一链合成			第一链合成
步	温度	时间	步	温度	时间
1	65 °摄氏度	5 分钟	1	65 °摄氏度	5 分钟
2	4 °C	拿	2	4 °C	拿
3	42 °摄氏度	45 分钟	3	25 °摄氏度	10 分钟
4	4 °C	拿	4	37 摄氏度	45 分钟
5	37 摄氏度	20 分钟	5	4 °C	拿
6	95 摄氏度	5 分钟
7	4 °C	拿	第二链合成
			步	温度	时间
第二链合成			1	95 摄氏度	2 分钟
步	温度	时间	2	4 °C	拿
1	95 摄氏度	2 分钟	3	37 摄氏度	15
2	4 °C	拿	4	70 摄氏度	5 分钟
3	25 °摄氏度	5 分钟	5	4 °C	拿
4	37 摄氏度	10 分钟
5	70 摄氏度	5 分钟	体外 转录
6	4 °C	拿	步	温度	时间
			1	42 °摄氏度	6 小时
体外 转录			2	4 °C	拿
步	温度	时间	3	37 摄氏度	15 分钟
1	42 °摄氏度	3 小时	4	4 °C	拿
2	4 °C	拿
3	37 摄氏度	15 分钟
4	4 °C	拿

表 1：扩增条件。

4. 定量扩增 RNA 的浓度和纯度。A260/230（纯度）和 A260/280（污染物）的吸光度比> 1.8 适合进一步分析。
   注：纯化的扩增 RNA 可用于重点基因表达研究（步骤 4.5-4.6），也可以送去进行微阵列分析。
5. 根据制造商的说明，使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒合成 cDNA。代表条件如下：
   • 25 °C 10 分钟
   • 37 °C 2 小时
   • 85 °C 5 分钟
   • 4 °C 保持
6. 根据制造商的说明，使用 0.5 μL cDNA 和 1 μM 引物（目标基因）进行定量 PCR。代表性条件和引物序列如下。
   1. 使用以下条件进行定量 PCR 条件：95 °C 反应 10 分钟;95°C 15 秒和 62°C 1 分钟的 40 次循环;95 °C 5 分钟;和 4°C 保持。
   2. 使用以下引物序列：
      GAPDH
      正向 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      反向 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17 系列
      正向 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      反向 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. 数据解释

1. 使用 ImageJ 使用步骤 1.6-1.8 中生成的 离体 组织图像计算伤口愈合速率。最近有多篇出版物重点介绍了如何在 ImageJ^12、13、14 中自动分析伤口区域的不同变化。
2. 使用 ΔC_T 方法定量基因表达，将目标基因的阈值循环与管家的阈值循环（例如，甘油醛-3-磷酸;GAPDH） 的为此，请记下管家和目标基因的 C_T 值。
   1. 计算两个 C_T 值之间的差异，以标准化存在的 mRNA 量并控制不同分离物之间 RNA 提取浓度的差异：
      ΔC_T = C_T （目标基因） - C_T （管家）
   2. 计算 C_T 值之间的差异大小，以给出目标基因的相对定量，表示为管家的百分比：
      相对定量 = （^2-ΔCT） x 100
   3. 通过比较每个样本的目标基因的相对定量来检查不同患者供体/疾病状态之间的差异。
      注意：整个技术的示意图可以在 图 1 中找到。

结果

按照协议，选择一个 48 小时的时间点来产生代表性的结果。在 图 2A 中可以看到选择性整容手术剩余组织中初始伤口的形成，其中切除的伤口清晰可见。苏木精和伊红染色证实这已经产生了全层伤口（图 2B）。48 小时后，在光学显微镜下可以看到伤口的部分闭合（图 2C）。组织学染色显示上皮舌正在进展...

讨论

随着全球 2 型糖尿病等慢性疾病发病率的增加，对能够促进病理生理相关研究的技术的需求变得更加迫切。上述方案提供了一种标准化方法，用于利用人体组织检查离 体 愈合伤口的转录组数据。

该方案取决于提供已获得相关当局伦理许可的剩余临床组织，以及已获得知情同意的患者。通常，这将来自接受截肢或择期整容手术的患者。需要仔?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix