Tip 2 Diyabette Bozulmuş Yara İyileşmesinde Anormal Gen Ekspresyonunu Tanımlamak için Cerrahi Dokular Üzerinde Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu

Özet

Bu teknik, ex vivo yaraların açılması, lazer yakalama mikrodiseksiyonu yapılması ve klinik olarak ilgili insan dokusu kullanılarak diyabette zayıf yara iyileşme süreçleriyle ilgili gen ekspresyonundaki değişikliklerin ölçülmesi için bir kılavuz sağlar.

Özet

Tip 2 diabetes mellitus (T2DM) küresel prevalansı hızlı bir şekilde artmaktadır. T2DM'li hastalar çok sayıda komplikasyondan muzdariptir ve bunlardan biri yara iyileşmesinin bozulmasıdır. Bu, iyileşmeyen yaraların veya ayak ülserlerinin gelişmesine ve nihayetinde amputasyona yol açabilir. Sağlıklı bireylerde yara iyileşmesi, iltihaplanma, proliferasyon ve yeniden şekillenmeyi kapsayan kontrollü ve örtüşen bir olaylar dizisini takip eder. T2DM'de bu adımlardan biri veya birkaçı işlevsiz hale gelir. T2DM'de bozulmuş yara iyileşmesini incelemek için mevcut modeller, yara iyileşmesini ve / veya potansiyel terapötik seçenekleri destekleyen moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro çizik yara tahlillerini, cilt eşdeğerlerini veya hayvan modellerini içerir. Bununla birlikte, bunlar T2DM hastalarında karmaşık yara iyileşme sürecini tam olarak özetlemez ve ex vivo insan derisi testleri, kötü iyileşeceği bilinen hastalardan punch biyopsi almanın etiği nedeniyle sorunludur. Burada, T2DM hastalarında (dis)fonksiyonel yara iyileşme yanıtında yer alan spesifik hücrelerin ekspresyon profillerinin, amputasyon veya elektif kozmetik cerrahi sonrası atılan fazla doku kullanılarak incelenebileceği bir teknik tanımlanmıştır. Bu protokolde, bağışlanan deri örnekleri toplanır, yaralanır, hava sıvı arayüzünde ex vivo olarak kültürlenir, farklı zaman noktalarında sabitlenir ve kesitlere ayrılır. Yara iyileşmesinde yer alan spesifik hücre tipleri (ör.epidermal keratinositler, dermal fibroblastlar (papiller ve retiküler), vaskülatür) lazer yakalama mikrodiseksiyonu ve dizileme veya mikrodizi ile analiz edilen gen ekspresyonundaki farklılıklar kullanılarak izole edilir ve ilgilenilen genler qPCR ile daha fazla doğrulanır. Bu protokol, diyabetli veya diyabetsiz hastalarda, ameliyattan sonra normal olarak atılan dokuyu kullanarak, hem kötü iyileşen hem de sağlam cilt arasındaki gen ekspresyonundaki doğal farklılıkları tanımlamak için kullanılabilir. T2DM kronik yaralarına ve alt ekstremite kaybına katkıda bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Giriş

Tip 2 diyabet insidansı, obezite salgını ve fiziksel hareketsizlik nedeniyle küresel olarak artmaktadır. Bu hastalarda kötü yara iyileşmesi yaygındır ve hastaların% 25'ine kadar kronik iyileşmeyen bir yara gelişir¹. Bunu destekleyen mekanizmalar karmaşıktır ve tam olarak anlaşılmamıştır, bu da yeni terapötikler için keşif oranını sınırlar. Buna katkıda bulunan faktörlerden biri, tip 2 diyabet hastalarında yara iyileşmesini incelemek için uygun bir modelin olmamasıdır. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, kronik yara riski taşıyanlarda yara iyileşmesini incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir ex vivo model sağlamak ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini ilerletmek için transkriptomik analize izin vermektir.

Şu anda yara iyileşmesini incelemek için birden fazla model mevcuttur ve her birinin güçlü ve zayıf yönleri vardır. db / db fare² veya streptozotosin ile indüklenen diyabetik sıçanlar³ gibi in vivo hayvan modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır; Bununla birlikte, kemirgen modellerindeki yaralar, insan vücudunda kullanılan mekanizmadan çok farklı olan kasılma yoluyla iyileşir ve klinik çalışmalara^geçişte sınırlı başarıya sahiptir ^4,5. İnsan dokusunu kullanmanın faydaları iyi bilinmektedir⁴, ancak zaten bozulmuş bir yara iyileşme tepkisini sürdürdüğü bilinen bireylere deneysel yaralar açmanın etiği ile karmaşıklaşmaktadır. Sonuç olarak, diyabetli insan denekler üzerinde yapılan çalışmalar, eksize edilmiş doku üzerinde deney yapmaktan ziyade daha yaygın olarak inflamatuar yanıta yöneliktir⁶. Çip üzerinde organ⁷ ve yapay cilt modelleri⁸ de mevcuttur. Bunlar, insan hücresi katkılarını analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak hastalar arası değişkenlik hakkında çok az gösterge verir. Bu nedenle, hassas hasta popülasyonlarında yara iyileşmesinin ilerlemesini incelemek için klinik olarak ilgili modeller, bu alandaki mekanik anlayışı ve ilaç keşfini hızlandırabilir.

Aşağıda açıklanan ex vivo yaralama protokolü Stojadinovic ve Tomic-Canic, 2013^9'dan uyarlanmıştır. İnsan doku örneklerinin ex vivo kontrollü yaralanmasından elde edilen transkripsiyonel verilerin incelenmesi için uygundur ve yara iyileşmesi kötü olan hastalardan (örneğin, tip 2 diyabet, yaşlı bireyler) alınan klinik örneklere uygulanabilir, böylece yara iyileşmesinin bu koşullarda nasıl etkilendiği ve potansiyel olarak nasıl restore edilebileceği hakkında bilgi edinmek için.

Protokol

Bu protokol, insan cerrahi dokusunun sağlanmasına dayanır. Deneyden önce etik onay ve bilgilendirilmiş hasta onayı alındı ve çalışma Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun hale geldi.

1. Doku toplanması ve ex vivo yaralama

1. Uzuv amputasyonu/ameliyatını takiben cerrahi dokuyu %5 penisilin-streptomisin-fungizon, 2 mM L-glutamin ve %10 fetal sığır serumu (FBS; tam büyüme ortamı) içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) içeren steril bir kaba toplayın.
   NOT: Bu şekilde toplanan doku, deneyden önce 4 °C'de 24 saate kadar saklanabilir. Ex vivo deneyler için dokunun canlılığını sağlamak için, dokunun mümkün olan en kısa sürede işlenmesi veya çoklu doku bağışlarında deneyleri standartlaştırmak için toplama ve yaralama arasında sabit bir zaman aralığı bırakılması önerilir. Doku herhangi bir süre saklanacaksa, RNA bütünlüğünü korumak için numuneye bir RNA stabilizasyon solüsyonu eklenmelidir.
2. Steril forseps kullanarak, dokuyu %5 penisilin-streptomisin-fungizon ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Steril bir neşter ve / veya cerrahi makas kullanarak dermisteki yağı kesin ve atın. Dokuyu steril PBS ile doldurulmuş taze bir petri kabına aktarın.
3. İki steril bıçağı, iki bıçak arasında 1 mm boşluk olacak şekilde birbirine takın. Epidermisin uzunluğu ve papiller dermisin üst kısmı boyunca ~ 1 mm aralıklarla iki paralel doğrusal çizgi çizin^10,11.
4. Doğrusal bir yara oluşturmak için steril forseps ve cerrahi makas kullanarak skor çizgileri arasındaki epidermisi çıkarın.
5. Dokuyu küçük dikdörtgenler halinde (maksimum 1 cm² boyutunda) kesmek için bir neşter kullanın, her iki tarafta sağlam epidermis ile yarayı çevreleyin.
   NOT: Doku ve müteakip RNA bütünlüğünü korumak için, 1.2-1.5 adımları mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir.
6. 4x büyütmede bir mikrodiseksiyon mikroskobu kullanarak yaralı dokunun bir görüntüsünü alın ve görüş alanının yaranın tamamını ve çevresindeki sağlam epidermal dokuyu yakaladığından emin olun.
7. Steril forseps kullanarak, doku dikdörtgenlerini 6 oyuklu bir plakaya bir doku kültürü ekine yerleştirin ve 2 mL tam büyüme ortamını kuyucuğa nazikçe pipetleyin. Bu, numunenin sıvı-hava arayüzünde kültürlenmesini sağlayacaktır.
8. 37 ° C'de% 5 CO₂ içinde havada 120 saate kadar inkübe edin.
   NOT: Doku, inkübasyonun sonunda adım 1.6'daki ile aynı büyütmede bir mikrodiseksiyon mikroskobunda görüntülenmelidir. Gerekirse her 24 saatte bir görüntü de çekilebilir.

2. Doku fiksasyonu ve kriyoseksiyon

1. Dokuyu sıvı nitrojen içinde dondurun. Bir kriyostat aynasına az miktarda kriyostat uyumlu kesme ortamı yerleştirin ve dokuyu içine gömün. Dokuyu aynaya dik olarak yönlendirin, böylece kesme yüzü yaralı alan da dahil olmak üzere cildin tüm katmanlarını kesecektir. -80 °C'de saklayın.
   NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. Kriyostatı oda sıcaklığında %70 etanol ve RNase dekontaminasyon spreyi ile temizleyin. Kriyostat sıcaklığını -28 °C'ye ayarlayın.
3. Mandren ve kriyostat bıçağının yönünün, yaralı doku ve alttaki dermis dahil olmak üzere dokunun tüm kalınlığını kapsayan bölümler üretip üretemeyeceğini kontrol edin.
4. Kriyostatı kullanarak, her yaradan on adet 7 μm'lik kesit kesin ve RNA içermeyen mikrodiseksiyon slaytlarına yerleştirin.
5. Slaytları, RNaz içermeyen bir ortam sağlamak için mikrodiseksiyon slaytlarının -80 ° C'de sağlandığı orijinal kutusunda saklayın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir, ancak depolama süresi uzadıkça RNA bozulmasının artacağını unutmayın.

3. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu

1. Mikrodiseksiyon slaytlarını doku bölümü ile birlikte kuru buza yerleştirin ve lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskop odasına gidin.
2. 1^{. slaytı} havayla kurutun ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu gerçekleştirmeden hemen önce RNaz içermeyen bir hematoksilen ve eozin boyama kiti kullanarak bölümleri hematoksilen ile boyamaya hızlı bir şekilde devam edin.
3. 10x büyütmede lazer yakalamalı mikrodiseksiyon mikroskobu kullanarak yaralı dokuyu görselleştirin ve lazerle çekilecek ilgi alanının fotoğrafını çekin.
4. Bu alanın etrafını (örneğin, epitel dili, granülasyon dokusu, mikrodamarlar) izleyin ve kullanılan özel mikroskop için yazılım talimatlarını kullanarak mikrodiseksiyon 0.5 mL difüzör izolasyon kapaklarında toplayın.
5. Diseke edilen dokunun yerini ve tam eksizyonunu göstermek için 10x büyütmede lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskobunu kullanarak lazerle yakalanan ilgi alanını yeniden görselleştirin ve görüntüleyin.
   NOT: RNA bozulmasını en aza indirmek için maksimum 1 saat boyunca her numune için (10 bölüme kadar) lazer yakalama gerçekleştirin.
6. Üreticinin talimatlarına göre mikrodiseke edilmiş dokuyu içeren tüpe RNA depolama tamponu ekleyin ve -80 ^° C'lik bir dondurucuya aktarılana kadar kuru buzda saklayın.
   NOT: Protokol burada geçici olarak duraklatılabilir.

4. Diferansiyel gen ekspresyonunun miktar tayini

1. Numune tüplerini 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek mikrodiseke edilmiş dokudan RNA'yı izole edin.
3. RNA'yı 12 μL RNaz içermeyen su nihai hacminde elute edin ve üreticinin talimatlarına göre bir RNA amplifikasyon kiti ve termal döngüleyici kullanarak RNA'yı amplifiye edin. Daha fazla analiz için yeterli RNA'yı sağlamak için iki tur amplifikasyon önerilir. Tablo 1'deki amplifikasyon koşullarını kullanın.

İlk amplifikasyon turu			İkinci büyütme turu
İlk iplik sentezi			İlk iplik sentezi
Adım	Sıcaklık	Saat	Adım	Sıcaklık	Saat
1	65 °C	5 dk	1	65 °C	5 dk
2	4 °C	tutmak	2	4 °C	tutmak
3	42 °C	45 dk	3	25 °C	10 dk
4	4 °C	tutmak	4	37 °C	45 dk
5	37 °C	20 dk	5	4 °C	tutmak
6	95 °C	5 dk
7	4 °C	tutmak	İkinci iplikçik sentezi
			Adım	Sıcaklık	Saat
İkinci iplikçik sentezi			1	95 °C	2 dk
Adım	Sıcaklık	Saat	2	4 °C	tutmak
1	95 °C	2 dk	3	37 °C	15
2	4 °C	tutmak	4	70 °C	5 dk
3	25 °C	5 dk	5	4 °C	tutmak
4	37 °C	10 dk
5	70 °C	5 dk	İn vitro transkripsiyon
6	4 °C	tutmak	Adım	Sıcaklık	Saat
			1	42 °C	6 saat
İn vitro transkripsiyon			2	4 °C	tutmak
Adım	Sıcaklık	Saat	3	37 °C	15 dk
1	42 °C	3 saat	4	4 °C	tutmak
2	4 °C	tutmak
3	37 °C	15 dk
4	4 °C	tutmak

Tablo 1: Amplifikasyon koşulları.

4. Amplifiye edilmiş RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını ölçün. A260/230 (saflık) ve A260/280 (kirleticiler) > 1.8 absorbans oranları daha fazla analiz için uygundur.
   NOT: Saflaştırılmış amplifiye edilmiş RNA, odaklanmış gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabilir (adım 4.5-4.6) veya mikrodizi analizi için gönderilebilir.
5. Üreticinin talimatlarına göre yüksek kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Temsilci koşulları aşağıdaki gibidir:
   • esnasında 25 10 dk
   • 2 saat boyunca 37 °C
   • esnasında 85 °C 5 dk
   • 4 °C tutma
6. Üreticinin talimatlarına göre 0.5 μL cDNA ve 1 μM primer (ilgilenilen genin) kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin. Temsili koşullar ve astar dizileri aşağıdaki gibidir.
   1. Kantitatif PCR koşulları için aşağıdaki koşulları kullanın: 10 dakika boyunca 95 °C; 15 saniye boyunca 95°C'de 40 döngü ve 1 dakika boyunca 62°C; 5 dakika boyunca 95 °C; ve 4 ° C tutun.
   2. Aşağıdaki astar dizilerini kullanın:
      GAPDH
      İleri 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Ters 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17 Serisi
      İleri 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Ters 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Verilerin yorumlanması

1. ImageJ kullanarak adım 1.6-1.8'de oluşturulan ex vivo dokunun görüntülerini kullanarak yara iyileşme oranını hesaplayın. ImageJ ^12,13,14'te yara alanlarının otomatik olarak nasıl analiz edileceğine dair farklı varyasyonları vurgulayan çok sayıda yeni yayın bulunmaktadır.
2. ΔC_T yöntemini kullanarak, ilgilenilen gen için eşik döngülerini temizlikçininkiyle karşılaştırarak gen ekspresyonunu ölçün (örneğin, gliseraldehit-3-fosfat; GAPDH). Bunu yapmak için, temizlikçi ve ilgilenilen gen için C_T değerini not edin.
   1. Mevcut mRNA miktarını normalleştirmek ve farklı izolasyonlar arasındaki RNA ekstraksiyon konsantrasyonlarındaki farklılıkları kontrol etmek için_{iki CT değeri} arasındaki farkı hesaplayın:
      ΔC_T = C_T (ilgilenilen gen) - C_T (temizlikçi)
   2. Temizlikçinin yüzdesi olarak ifade edilen, ilgilenilen genin nispi nicelleştirmesini vermek için C_T değerleri arasındaki farkın büyüklüğünü hesaplayın:
      Bağıl nicelik ölçümü = (^2-ΔCT) x 100
   3. Her örnek için ilgilenilen genlerin nispi niceliklerini karşılaştırarak farklı hasta donörleri / hastalık durumları arasındaki farkları inceleyin.
      NOT: Tüm tekniğin bir şeması Şekil 1'de bulunabilir.

Sonuçlar

Protokolün ardından, temsili sonuçlar elde etmek için 48 saatlik bir zaman noktası seçildi. Elektif kozmetik cerrahiden elde edilen fazla dokuda ilk yaranın oluşturulması, eksize edilen yaranın açıkça görülebildiği Şekil 2A'da görülebilir. Hematoksilen ve eozin boyama, bunun tam kalınlıkta bir yara oluşturduğunu doğrular (Şekil 2B). 48 saat sonra, yaranın kısmi kapanması ışık mikroskobu altında g?...

Tartışmalar

Tip 2 diyabet gibi kronik bozuklukların görülme sıklığı küresel olarak arttıkça, patofizyolojik olarak ilgili çalışmaları kolaylaştırabilecek tekniklere olan ihtiyaç daha acil hale gelmektedir. Yukarıda açıklanan protokol, insan dokusunu kullanarak ex vivo iyileşen yaralardan elde edilen transkriptomik verileri incelemek için standart bir yöntem sağlar.

Bu protokol, ilgili otoriteden etik izin verilmiş fazla klinik dokunun ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix