2型糖尿病の創傷治癒障害における異常な遺伝子発現を特定するための外科組織のレーザーキャプチャマイクロダイセクション

要約

この技術は、臨床的に関連性のあるヒト組織を使用して、 ex vivo 創傷を負わせ、レーザー捕捉マイクロダイセクションを実施し、糖尿病の創傷治癒不良に関連する遺伝子発現の変化を定量化するためのガイドを提供します。

要約

2型糖尿病(T2DM)の世界的な有病率は急速に増加しています。2型糖尿病の患者は多くの合併症に苦しんでおり、そのうちの1つが創傷治癒の障害です。これは、治癒しない痛みや足の潰瘍の発症につながり、最終的には切断につながる可能性があります。健康な人では、創傷治癒は、炎症、増殖、リモデリングを含む制御された重複する一連のイベントに従います。T2DMでは、これらのステップの1つ以上が機能不全になります。T2DMにおける創傷治癒障害を研究するための現在のモデルには、in vitroスクラッチ創傷アッセイ、皮膚同等物、または創傷治癒を支える分子メカニズムや潜在的な治療オプションを調べるための動物モデルなどがあります。しかし、これらは 2 型糖尿病患者の複雑な創傷治癒プロセスを完全に再現するものではなく、 ex vivo ヒト皮膚試験は、治癒が不十分であることがわかっている患者からパンチ生検を受ける倫理のために問題があります。ここでは、T2DM患者における(機能不全の)創傷治癒応答に関与する特定の細胞の発現プロファイルを、切断または選択的美容整形手術後に廃棄された余剰組織を用いて調べることができる技術について説明する。このプロトコルでは、提供された皮膚のサンプルが収集され、傷つけられ、空気液界面で ex vivo で培養され、異なる時点で固定され、切片化されます。創傷治癒に関与する特定の細胞タイプ(表皮ケラチノサイト、真皮線維芽細胞(乳頭状および網状)、血管系など)は、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを使用して単離され、シーケンシングまたはマイクロアレイによって遺伝子発現の違いが分析され、目的の遺伝子がqPCRによってさらに検証されます。このプロトコルは、通常手術後に廃棄される組織を使用して、糖尿病の有無にかかわらず、治癒不良の皮膚と無傷の皮膚との間の遺伝子発現の固有の違いを特定するために使用できます。これにより、2 型糖尿病の慢性創傷と下肢の喪失に寄与する分子メカニズムの理解が深まります。

概要

2型糖尿病の発生率は、肥満の蔓延と運動不足によって世界的に増加しています。これらの患者では創傷治癒不良が一般的であり、患者の最大25%が慢性的な非治癒性創傷を発症します¹。これを支えるメカニズムは複雑で、完全には理解されていないため、新しい治療法の発見率が制限されています。その要因の一つは、2型糖尿病患者の創傷治癒を研究するための適切なモデルがないことです。したがって、この方法の目的は、慢性創傷のリスクがある人々の創傷治癒を調べるための生理学的に関連性のある ex vivo モデルを提供し、トランスクリプトーム分析が新しい治療標的の同定を進めることを可能にすることです。

現在、創傷治癒を研究するために利用可能なモデルは複数あり、それぞれに長所と短所があります。db/dbマウス²またはストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラット³などのインビボ動物モデルが広く使用されている。しかし、げっ歯類モデルの創傷は収縮によって治癒し、これは人体で採用されているメカニズムとは大きく異なり、臨床試験への応用には限定的な成功しかありません^4,5。ヒト組織を使用することの利点はよく認識されています^{が 4}、障害のある創傷治癒反応を維持することがすでに知られている個人に実験的な傷を負わせるという倫理によって複雑になります。その結果、糖尿病のヒト被験者に関する研究は、切除された組織で実験するよりも、炎症反応に向けられるのが一般的です⁶。Organ-on-a-chip⁷、人工皮膚モデル⁸もご用意しています。これらには、ヒト細胞の寄与を分析できるという利点がありますが、患者間のばらつきはほとんど示されません。したがって、脆弱な患者集団における創傷治癒の進行を研究するための臨床的に関連性のあるモデルは、この領域におけるメカニズムの理解と創薬を加速させる可能性があります。

以下に説明する ex vivo 創傷プロトコルは、Stojadinovic and Tomic-Canic, 2013⁹から採用されています。これは、ヒト組織サンプルの制御された創傷からの転写データを ex vivo で調べるのに適しており、創傷治癒が不十分な患者(2型糖尿病、高齢者など)の臨床サンプルに適用して、これらの状態で創傷治癒がどのように影響を受けるか、そして潜在的にどのように回復できるかについての知識を深めることができます。

プロトコル

このプロトコルは、人間の手術組織の提供に依存しています。実験に先立ち、倫理的承認とインフォームド・ペイシェント・コンセントが得られ、研究はヘルシンキ宣言に概説された原則に準拠していました。

1. 組織採取と ex vivo 創傷

1. 四肢の切断/手術後の手術組織を、5%ペニシリン-ストレプトマイシン-真菌ゾン、2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS;完全増殖培地)を含むダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を含む滅菌容器に収集します。.
   注:この方法で収集された組織は、実験前に4°Cで最大24時間保存できます。 ex vivo 実験のための組織の生存率を確保するために、できるだけ早く組織を処理するか、収集と創傷の間に一定の時間間隔を維持して、複数の組織提供にわたる実験を標準化することをお勧めします。組織を任意の時間保存する場合は、RNAの完全性を維持するために、RNA安定化溶液をサンプルに追加する必要があります。
2. 滅菌鉗子を使用して、5%ペニシリン-ストレプトマイシン-真菌ゾンを補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた60mmシャーレに組織を移します。滅菌メスや手術用ハサミを使用して真皮の脂肪を切り取り、廃棄します。滅菌PBSで満たされた新鮮なシャーレに組織を移します。
3. 2つの滅菌ブレードの間に1mmの隙間が空くように、2つの滅菌ブレードを一緒に取り付けます。表皮の長さと乳頭状真皮の上部を横切って、~1 mm 間隔で 2 本の平行な直線にスコアを付けます^10,11。
4. 滅菌鉗子と手術用ハサミを使用してスコアラインの間の表皮を取り除き、線状の傷を作成します。
5. メスを使用して、組織を小さな長方形(最大サイズ1 cm²)に切断し、両側に無傷の表皮で傷を囲みます。
   注:組織およびその後のRNAの完全性を維持するために、ステップ1.2-1.5をできるだけ早く実施する必要があります。
6. マイクロダイセクション顕微鏡を4倍の倍率で使用して、傷口全体と周囲の無傷の表皮組織を視野が捉えるように、損傷した組織の画像を撮影します。
7. 滅菌鉗子を使用して、組織の長方形を6ウェルプレートの組織培養インサートに置き、2 mLの完全な増殖培地をウェルに静かにピペットで移します。これにより、サンプルが液体と空気の界面で確実に培養されます。
8. 37°Cで5%_CO2 空気中で最大120時間インキュベートします。
   注:組織は、インキュベーション終了時にステップ1.6と同じ倍率でマイクロダイセクション顕微鏡でイメージングする必要があります。必要に応じて、24時間ごとに画像を撮影することもできます。

2. 組織固定と凍結切片

1. スナップで組織を液体窒素で凍結します。クライオスタット対応の切断媒体を少量のクライオスタットチャックに置き、その中に組織を埋め込みます。組織をチャックに対して垂直に向け、切断面が傷のある領域を含む皮膚のすべての層を切断するようにします。-80°Cで保存してください。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。
2. クライオスタットを室温で70%エタノールとRNase除染スプレーで洗浄します。クライオスタットの温度を-28°Cに設定します。
3. チャックとクライオスタットブレードの向きが、損傷した組織とその下にある真皮を含む組織の全厚さを包含する切片を生成できることを確認してください。
4. クライオスタットを使用して、各創傷から最大10個の7 μm切片を切り取り、RNAフリーのマイクロダイセクションスライドに置きます。
5. スライドは、マイクロダイセクションスライドが提供された元の箱に-80°Cで保管し、RNaseフリーの環境を確保します。
   注:ここでプロトコールを一時停止することもできますが、保存時間が長くなるほどRNAの分解が増加することに注意してください。

3. レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

1. マイクロダイセクションスライドを組織切片と一緒にドライアイスに置き、レーザーキャプチャマイクロダイセクション顕微鏡室に移動します。
2. 1^枚 目のスライドを風乾し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施する直前に、RNaseを含まないヘマトキシリンおよびエオシン染色キットを使用して、ヘマトキシリンで切片を染色します。
3. レーザーキャプチャーマイクロダイセクション顕微鏡を使用して10倍の倍率で損傷した組織を視覚化し、レーザーキャプチャされる対象領域の写真を撮ります。
4. その領域(例えば、上皮舌、肉芽組織、微小血管)の周囲をトレースし、使用している特定の顕微鏡のソフトウェアの指示に従って、0.5 mLディフューザー分離キャップをマイクロダイセクションに収集します。
5. レーザーキャプチャーマイクロダイセクション顕微鏡を10倍の倍率で使用して、レーザーキャプチャされた関心領域を再視覚化およびイメージングし、解剖された組織の位置と完全な切除を実証します。
   注:各サンプル(最大10切片)に対してレーザーキャプチャを最大1時間実行して、RNAの分解を最小限に抑えます。
6. 顕微鏡解剖した組織が入ったチューブに、メーカーの指示に従ってRNA保存バッファーを添加し、-80^°Cの冷凍庫に移すことができるまでドライアイスで保存します。
   注:ここでプロトコルを一時的に一時停止できます。

4. 差次的遺伝子発現の定量化

1. サンプルチューブを全速力で1分間遠心分離します。
2. 顕微鏡解剖した組織からRNAをメーカーの指示に従って単離します。
3. 最終容量の12 μLのRNase遊離水でRNAを溶出し、製造元の指示に従って、RNA増幅キットとサーマルサイクラーを使用してRNAを増幅します。さらなる分析に十分なRNAを確保するために、2ラウンドの増幅が推奨されます。 表1の増幅条件を使用します。

最初の増幅ラウンド			2回目の増幅ラウンド
ファーストストランド合成			ファーストストランド合成
歩	温度	時間	歩	温度	時間
1	65°C	5分間	1	65°C	5分間
2	4 °C	持つ	2	4 °C	持つ
3	42°C	45分	3	25°C	10分間
4	4 °C	持つ	4	37°C	45分
5	37°C	20分	5	4 °C	持つ
6	95°C	5分間
7	4 °C	持つ	セカンドストランド合成
			歩	温度	時間
セカンドストランド合成			1	95°C	2分間
歩	温度	時間	2	4 °C	持つ
1	95°C	2分間	3	37°C	15
2	4 °C	持つ	4	70°C	5分間
3	25°C	5分間	5	4 °C	持つ
4	37°C	10分間
5	70°C	5分間	インビトロ 転写
6	4 °C	持つ	歩	温度	時間
			1	42°C	6時間
インビトロ 転写			2	4 °C	持つ
歩	温度	時間	3	37°C	15分
1	42°C	3時間	4	4 °C	持つ
2	4 °C	持つ
3	37°C	15分
4	4 °C	持つ

表1:増幅条件。

4. 増幅されたRNAの濃度と純度を定量します。A260/230(純度)およびA260/280(汚染物質)>1.8の吸光度比は、さらなる分析に適しています。
   注:精製された増幅されたRNAは、焦点を絞った遺伝子発現研究(ステップ4.5-4.6)に使用することも、マイクロアレイ分析のために送付することもできます。
5. 大容量cDNA逆転写キットを使用して、メーカーの指示に従ってcDNAを合成します。代表的な条件は、以下のとおりです。
   • 25°Cで10分間
   • 37°Cで2時間
   • 85°Cで5分間
   • 4°Cホールド
6. メーカーの指示に従って、0.5 μLのcDNAと1 μMのプライマー(目的遺伝子の)を使用して定量PCRを実施します。代表的な条件とプライマー配列は以下の通りです。
   1. 定量的PCR条件には、以下の条件を使用してください:95°Cで10分間;95°Cで15秒間、62°Cで1分間の40サイクル。95°Cで5分間;4°Cホールド。
   2. 以下のプライマー配列を使用してください。
      ガプド
      フォワード 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      リバース 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      フォワード 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      リバース 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. データの解釈

1. ImageJを使用してステップ1.6-1.8で生成されたex vivo組織の画像を使用して、創傷治癒速度を計算します。ImageJ 12,13,14で創傷領域を自動的に分析する方法について、さまざまなバリエーションを強調した最近の複数の出版物があります。
2. ΔC_T 法を使用して遺伝子発現を定量し、目的の遺伝子の閾値サイクルをハウスキーパーの閾値サイクルと比較します(例:グリセルアルデヒド-3-リン酸;GAPDH) です。これを行うには、ハウスキーパーと目的の遺伝子の C_T 値に注意してください。
   1. 2つのC_T 値の差を計算して、存在するmRNAの量を正規化し、異なる単離間のRNA抽出濃度の違いを制御します。
      ΔC_T = C_T (目的の遺伝子) - C_T (家政婦)
   2. _{C T} 値間の差の大きさを計算して、目的の遺伝子の相対的な定量化をハウスキーパーのパーセンテージとして表します。
      相対定量 = (^2-ΔCT) x 100
   3. 各サンプルの関心のある遺伝子の相対的な定量を比較することにより、異なる患者ドナー/疾患状態間の違いを調べます。
      注: 手法全体の概略図を 図 1 に示します。

結果

プロトコールに従って、代表的な結果を生成するために48時間のタイムポイントを選択しました。選択的美容整形手術による余剰組織における初期創傷の形成は、切除された創傷がはっきりと見える 図2A で見ることができる。ヘマトキシリンとエオシンの染色により、これが全層創傷を生じたことが確認されています(図2B...

ディスカッション

2型糖尿病などの慢性疾患の発生率が世界的に増加するにつれて、病態生理学的に関連する研究を促進する技術の必要性がますます急務になっています。上述のプロトコルは、ヒト組織を利用して創傷を治癒 するex vivo からのトランスクリプトームデータを調べるための標準化された方法を提供する。

このプロトコルは、関連当局から倫理...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix