Microdissection par capture laser sur des tissus chirurgicaux pour identifier l’expression génique aberrante dans la cicatrisation des plaies altérée dans le diabète de type 2

Résumé

Cette technique fournit un guide pour infliger des plaies ex vivo , effectuer une microdissection par capture laser et quantifier les changements dans l’expression génique liés à de mauvais processus de cicatrisation des plaies dans le diabète en utilisant des tissus humains cliniquement pertinents.

Résumé

La prévalence mondiale du diabète sucré de type 2 (DT2) augmente à un rythme rapide. Les patients atteints de DT2 souffrent d’une multitude de complications et l’une d’entre elles est une cicatrisation altérée. Cela peut entraîner le développement de plaies non cicatrisantes ou d’ulcères du pied et, finalement, l’amputation. Chez les personnes en bonne santé, la cicatrisation des plaies suit une séquence contrôlée et chevauchante d’événements englobant l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Dans le DT2, une ou plusieurs de ces étapes deviennent dysfonctionnelles. Les modèles actuels pour étudier la cicatrisation altérée des plaies dans le DT2 comprennent des tests de plaie par égratignure in vitro, des équivalents cutanés ou des modèles animaux pour examiner les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la cicatrisation des plaies et/ou les options thérapeutiques potentielles. Cependant, ceux-ci ne récapitulent pas complètement le processus complexe de cicatrisation des plaies chez les patients atteints de DT2, et les tests de peau humaine ex vivo sont problématiques en raison de l’éthique de prendre des biopsies à l’emporte-pièce sur des patients où l’on sait qu’elles guériront mal. Ici, une technique est décrite qui permet d’examiner les profils d’expression des cellules spécifiques impliquées dans la réponse (dys)fonctionnelle de cicatrisation des plaies chez les patients atteints de DT2 à l’aide de tissus excédentaires jetés à la suite d’une amputation ou d’une chirurgie esthétique élective. Dans ce protocole, des échantillons de peau donnée sont collectés, blessés, cultivés ex vivo dans l’interface air-liquide, fixés à différents points temporels et sectionnés. Des types cellulaires spécifiques impliqués dans la cicatrisation des plaies (par exemple, les kératinocytes épidermiques, les fibroblastes dermiques (papillaires et réticulaires), le système vasculaire) sont isolés à l’aide de la microdissection par capture laser et les différences d’expression génique analysées par séquençage ou microréseau, les gènes d’intérêt étant validés par qPCR. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les différences inhérentes dans l’expression génique entre une peau mal cicatrisante et une peau intacte, chez les patients diabétiques ou non, en utilisant des tissus habituellement jetés après la chirurgie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contribuant aux plaies chroniques du DT2 et à la perte des membres inférieurs.

Introduction

L’incidence du diabète de type 2 augmente à l’échelle mondiale, en raison d’une épidémie d’obésité et de l’inactivité physique. Une mauvaise cicatrisation des plaies est fréquente chez ces patients et jusqu’à 25 % des patients développeront une plaie chronique non cicatrisante¹. Les mécanismes qui sous-tendent cette situation sont complexes et mal compris, ce qui limite le taux de découverte de nouveaux traitements. L’un des facteurs qui y contribuent est l’absence d’un modèle approprié pour étudier la cicatrisation des plaies chez les patients atteints de diabète de type 2. Ainsi, l’objectif de cette méthode est de fournir un modèle ex vivo physiologiquement pertinent pour examiner la cicatrisation des plaies chez les personnes à risque de plaies chroniques, permettant une analyse transcriptomique pour faire progresser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Il existe actuellement plusieurs modèles pour étudier la cicatrisation des plaies, et chacun a ses forces et ses faiblesses. Les modèles animaux in vivo, tels que la souris db/db² ou les rats diabétiques induits par la streptozotocine³ sont largement utilisés ; Cependant, les plaies chez les modèles de rongeurs guérissent par contraction, ce qui est très différent du mécanisme utilisé dans le corps humain, et ont un succès limité dans l’application aux essais cliniques ^4,5. Les avantages de l’utilisation de tissus humains sont bien reconnus⁴, mais sont compliqués par l’éthique d’infliger des blessures expérimentales à des personnes qui sont déjà connues pour maintenir une réponse de cicatrisation altérée. Par conséquent, les études sur des sujets humains atteints de diabète sont plus souvent orientées vers la réponse inflammatoire plutôt que vers l’expérimentation sur des tissus excisés⁶. Organ-on-a-Chip⁷ et les modèles de peau artificielle⁸ sont également disponibles. Ceux-ci ont l’avantage de pouvoir analyser les contributions des cellules humaines mais donnent peu d’indications sur la variabilité inter-patients. Ainsi, des modèles cliniquement pertinents pour étudier les progrès de la cicatrisation des plaies chez les populations de patients vulnérables pourraient accélérer la compréhension mécaniste et la découverte de médicaments dans ce domaine.

Le protocole de blessure ex vivo décrit ci-dessous est adapté de Stojadinovic et Tomic-Canic, 2013⁹. Il convient à l’examen des données transcriptionnelles provenant de blessures contrôlées d’échantillons de tissus humains ex vivo et peut être appliqué à des échantillons cliniques de patients présentant une mauvaise cicatrisation des plaies (par exemple, le diabète de type 2, les personnes âgées), afin de faire progresser les connaissances sur l’impact de la cicatrisation des plaies dans ces conditions et potentiellement sur la manière dont elle peut être restaurée.

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Protocole

Ce protocole repose sur la fourniture de tissus chirurgicaux humains. L’approbation éthique et le consentement éclairé du patient ont été obtenus avant l’expérimentation, et l’étude s’est conformée aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki.

1. Prélèvement de tissus et plaies ex vivo

1. Prélever du tissu chirurgical après l’amputation ou la chirurgie d’un membre dans un contenant stérile contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) avec 5 % de pénicilline-streptomycine-fungizone, 2 mM de L-glutamine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS ; milieu de croissance complet).
   REMARQUE : Les tissus prélevés de cette manière peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 24 h avant l’expérimentation. Pour assurer la viabilité des tissus pour les expériences ex vivo , il est recommandé de traiter les tissus dès que possible ou de maintenir un intervalle de temps fixe entre le prélèvement et la blessure afin de normaliser les expériences sur plusieurs dons de tissus. Si le tissu doit être stocké pendant un certain temps, une solution de stabilisation de l’ARN doit être ajoutée à l’échantillon pour maintenir l’intégrité de l’ARN.
2. À l’aide d’une pince stérile, transférez le tissu dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile complétée par une zone fongique de pénicilline-streptomycine à 5 %. Coupez la graisse du derme à l’aide d’un scalpel stérile et/ou de ciseaux chirurgicaux et jetez-le. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri fraîche remplie de PBS stérile.
3. Fixez deux lames stériles ensemble de manière à ce qu’il y ait un espace de 1 mm entre les deux lames. Marquez deux lignes linéaires parallèles, distantes de ~1 mm, sur la longueur de l’épiderme et la partie supérieure du derme papillaire^10,11.
4. Retirez l’épiderme entre les lignes de rainure à l’aide d’une pince stérile et de ciseaux chirurgicaux pour créer une plaie linéaire.
5. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu en petits rectangles (taille maximale de 1^cm2) englobant la plaie avec l’épiderme intact de chaque côté.
   REMARQUE : Pour maintenir l’intégrité des tissus et de l’ARN subséquent, les étapes 1.2 à 1.5 doivent être effectuées le plus rapidement possible.
6. Prenez une image du tissu blessé à l’aide d’un microscope à microdissection à un grossissement de 4x, en veillant à ce que le champ de vision capture l’intégralité de la plaie et le tissu épidermique intact environnant.
7. À l’aide d’une pince stérile, placez les rectangles de tissu sur un insert de culture tissulaire dans une plaque à 6 puits et pipetez doucement 2 ml de milieu de croissance complet dans le puits. Cela garantira que l’échantillon est cultivé à l’interface liquide-air.
8. Incuber à 37 °C dans 5 % de CO₂ dans l’air jusqu’à 120 h.
   REMARQUE : Le tissu doit être imagé sur un microscope à microdissection au même grossissement qu’à l’étape 1.6 à la fin de l’incubation. Des images peuvent également être prises toutes les 24 h si nécessaire.

2. Fixation tissulaire et cryosection

1. Congelez rapidement le tissu dans de l’azote liquide. Placez une petite quantité de milieu de coupe compatible avec le cryostat sur un mandrin de cryostat et incrustez-y le tissu. Orientez le tissu perpendiculairement au mandrin de manière à ce que la face de coupe coupe à travers toutes les couches de la peau, y compris la zone blessée. Conserver à -80 °C.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Nettoyez le cryostat à température ambiante avec un spray de décontamination à 70 % d’éthanol et de RNase. Réglez la température du cryostat sur -28 °C.
3. Vérifiez que l’orientation du mandrin et de la lame du cryostat peut produire des sections qui englobent toute l’épaisseur du tissu, y compris le tissu blessé et le derme sous-jacent.
4. À l’aide du cryostat, découpez jusqu’à dix sections de 7 μm dans chaque plaie et placez-les sur des lames de microdissection sans ARN.
5. Conservez les lames dans la boîte d’origine dans laquelle les lames de microdissections ont été fournies à -80 °C pour garantir un environnement exempt de RNase.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici, mais sachez que la dégradation de l’ARN augmentera avec le temps de stockage.

3. Microdissection par capture laser

1. Placez les lames de microdissection avec la section de tissu dans de la glace carbonique et rendez-vous dans la salle de microscope de microdissection par capture laser.
2. Séchez à l’air libre la 1ère^{lame et} procédez rapidement à la coloration des sections avec de l’hématoxyline à l’aide d’un kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine sans RNase immédiatement avant d’effectuer la microdissection par capture laser.
3. Visualisez le tissu blessé à l’aide d’un microscope de microdissection à capture laser à un grossissement de 10x et prenez une photo de la zone d’intérêt qui sera capturée au laser.
4. Tracez autour de cette zone (par exemple, la langue épithéliale, le tissu de granulation, les microvaisseaux) et collectez en microdissection des capuchons d’isolement de diffuseur de 0,5 mL en utilisant les instructions du logiciel du microscope utilisé.
5. Revisualisez et imagez la zone d’intérêt capturée au laser à l’aide du microscope de microdissection à capture laser à un grossissement de 10x pour démontrer l’emplacement et l’excision complète du tissu disséqué.
   REMARQUE : Effectuez une capture laser pour chaque échantillon (jusqu’à 10 sections) pendant une durée maximale de 1 h afin de minimiser la dégradation de l’ARN.
6. Ajoutez un tampon de stockage d’ARN dans le tube contenant le tissu microdisséqué selon les instructions du fabricant et conservez-le dans de la glace sèche jusqu’à ce qu’il puisse être transféré dans un congélateur à -80 ^°C.
   REMARQUE : Le protocole peut être temporairement suspendu ici.

4. Quantification de l’expression différentielle des gènes

1. Centrifuger les tubes d’échantillon à pleine vitesse pendant 1 min.
2. Isolez l’ARN du tissu microdisséqué en suivant les instructions du fabricant.
3. Éluer l’ARN dans un volume final de 12 μL d’eau libre de RNase et amplifier l’ARN à l’aide d’un kit d’amplification d’ARN et d’un thermocycleur, selon les instructions du fabricant. Deux cycles d’amplification sont recommandés pour garantir une quantité suffisante d’ARN pour une analyse plus approfondie. Utilisez les conditions d’amplification du tableau 1.

Premier tour d’amplification			Deuxième tour d’amplication
Synthèse du premier brin			Synthèse du premier brin
Pas	Température	Heure	Pas	Température	Heure
1	65 °C	Durée : 5 minutes	1	65 °C	Durée : 5 minutes
2	4 °C	tenir	2	4 °C	tenir
3	42 °C	Durée : 45 minutes	3	25 °C	Durée : 10 minutes
4	4 °C	tenir	4	37 °C	Durée : 45 minutes
5	37 °C	Durée : 20 minutes	5	4 °C	tenir
6	95 °C	Durée : 5 minutes
7	4 °C	tenir	Synthèse du deuxième brin
			Pas	Température	Heure
Synthèse du deuxième brin			1	95 °C	2 min
Pas	Température	Heure	2	4 °C	tenir
1	95 °C	2 min	3	37 °C	15
2	4 °C	tenir	4	70 °C	Durée : 5 minutes
3	25 °C	Durée : 5 minutes	5	4 °C	tenir
4	37 °C	Durée : 10 minutes
5	70 °C	Durée : 5 minutes	Transcription in vitro
6	4 °C	tenir	Pas	Température	Heure
			1	42 °C	6 h
Transcription in vitro			2	4 °C	tenir
Pas	Température	Heure	3	37 °C	Durée : 15 minutes
1	42 °C	3 h	4	4 °C	tenir
2	4 °C	tenir
3	37 °C	Durée : 15 minutes
4	4 °C	tenir

Tableau 1 : Conditions d’amplification.

4. Quantifier la concentration et la pureté de l’ARN amplifié. Les rapports d’absorbance A260/230 (pureté) et A260/280 (contaminants) > 1,8 conviennent à une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : L’ARN amplifié purifié peut être utilisé pour des études ciblées de l’expression génique (étapes 4.5-4.6) ou peut être envoyé pour une analyse sur microréseau.
5. Synthétisez l’ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse d’ADNc de grande capacité conformément aux instructions du fabricant. Les conditions représentatives sont les suivantes :
   • 25 °C pendant 10 min
   • 37 °C pendant 2 h
   • 85 °C pendant 5 min
   • Maintien à 4 °C
6. Effectuez une PCR quantitative à l’aide de 0,5 μL d’ADNc et de 1 μM d’amorces (du gène d’intérêt) selon les instructions du fabricant. Les conditions représentatives et les séquences d’amorces sont les suivantes.
   1. Utilisez les conditions suivantes pour les conditions de PCR quantitative : 95 °C pendant 10 minutes ; 40 cycles de 95°C pendant 15 s et 62°C pendant 1 min ; 95 °C pendant 5 min ; et une tenue de 4°C.
   2. Utilisez les séquences d’amorces suivantes :
      GAPDH
      Vers l’avant 5'-TATAAATTGAGCGCGCGCCC-3'
      Inverser 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Vers l’avant 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Inversé 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interprétation des données

1. Calculez le taux de cicatrisation des plaies à l’aide des images du tissu ex vivo générées aux étapes 1.6 à 1.8 à l’aide d’ImageJ. Il existe de nombreuses publications récentes mettant en évidence différentes variantes sur la façon d’analyser automatiquement les zones de plaie dans ImageJ 12,13,14.
2. Quantifier l’expression génique à l’aide de la méthode ΔC_T , en comparant les cycles de seuil du gène d’intérêt par rapport à celui de la femme de ménage (par exemple, glycéraldéhyde-3-phosphate ; GAPDH). Pour ce faire, notez la valeur C_T pour la gouvernante et pour le gène d’intérêt.
   1. Calculez la différence entre les deux valeurs C_T pour normaliser la quantité d’ARNm présente et contrôler les différences de concentrations d’extraction d’ARN entre les différents isolements :
      ΔC_T = C_T (gène d’intérêt) - C_T (femme de ménage)
   2. Calculez l’amplitude de la différence entre les valeurs C_T pour obtenir la quantification relative du gène d’intérêt, exprimée en pourcentage de la femme de ménage :
      Quantification relative = (^2-ΔCT) x 100
   3. Examinez les différences entre les différents donneurs de patients/états pathologiques en comparant les quantifications relatives des gènes d’intérêt pour chaque échantillon.
      REMARQUE : Un schéma de l’ensemble de la technique se trouve à la figure 1.

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Résultats

Suivant le protocole, un point de temps de 48 h a été choisi pour générer des résultats représentatifs. La création de la plaie initiale dans le tissu excédentaire de la chirurgie esthétique élective peut être vue sur la figure 2A où la plaie excisée est clairement visible. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine confirme que cela a généré une plaie de pleine épaisseur (Figure 2B). Après 48 h, la f...

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Discussion

Alors que l’incidence de troubles chroniques tels que le diabète de type 2 augmente à l’échelle mondiale, le besoin de techniques capables de faciliter les études pathophysiologiques pertinentes devient plus urgent. Le protocole décrit ci-dessus fournit une méthode normalisée pour examiner les données transcriptomiques des plaies en cicatrisation ex vivo utilisant des tissus humains.

Ce protocole dépend de la fourniture de tissus clinique...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix