Лазерная микродиссекция хирургических тканей для выявления аберрантной экспрессии генов при нарушенном заживлении ран при сахарном диабете 2 типа

Резюме

Этот метод дает руководство по нанесению ран ex vivo , выполнению микродиссекции лазерного захвата и количественной оценке изменений экспрессии генов, связанных с плохими процессами заживления ран при диабете, с использованием клинически значимых тканей человека.

Аннотация

Глобальная распространенность сахарного диабета 2 типа (СД2) растет быстрыми темпами. Пациенты с СД2 страдают от множества осложнений, одним из которых является нарушение заживления ран. Это может привести к развитию незаживающих язв или язв на стопе и, в конечном итоге, к ампутации. У здоровых людей заживление ран следует контролируемой и перекрывающейся последовательности событий, охватывающей воспаление, пролиферацию и ремоделирование. При СД2 один или несколько из этих этапов становятся дисфункциональными. Современные модели для изучения нарушения заживления ран при СД2 включают анализы царапин ран in vitro, кожные эквиваленты или животные модели для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе заживления ран, и/или потенциальных терапевтических вариантов. Тем не менее, они не полностью повторяют сложный процесс заживления ран у пациентов с СД2, а кожные тесты ex vivo у человека проблематичны из-за этичности взятия пункционной биопсии у пациентов, у которых известно, что они плохо заживут. Здесь описан метод, с помощью которого профили экспрессии специфических клеток, участвующих в (дис)функциональной реакции заживления ран у пациентов с СД2, могут быть исследованы с использованием излишков ткани, отброшенных после ампутации или плановой косметической хирургии. В этом протоколе образцы донорской кожи собираются, ранятся, культивируются ex vivo на границе раздела воздушной жидкости, фиксируются в разные моменты времени и разрезаются. Конкретные типы клеток, участвующие в заживлении ран (например, эпидермальные кератиноциты, дермальные фибробласты (папиллярные и сетчатые), сосудистая сеть) выделяют с помощью микродиссекции лазерного захвата, а различия в экспрессии генов анализируют с помощью секвенирования или микрочипа, а представляющие интерес гены дополнительно валидируют с помощью количественной ПЦР. Этот протокол может быть использован для выявления врожденных различий в экспрессии генов между плохо заживающей и неповрежденной кожей у пациентов с диабетом или без него, используя ткани, обычно отбраковываемые после операции. Это позволит лучше понять молекулярные механизмы, способствующие развитию хронических ран при СД2 и потере нижних конечностей.

Введение

Заболеваемость диабетом 2 типа растет во всем мире, что обусловлено эпидемией ожирения и отсутствием физической активности. У этих пациентов часто наблюдается плохое заживление ран, и у 25% пациентов развивается хроническая незаживающая рана¹. Механизмы, лежащие в основе этого, сложны и не до конца понятны, что ограничивает скорость открытия новых методов лечения. Одним из факторов, способствующих этому, является отсутствие подходящей модели для изучения заживления ран у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Таким образом, цель данного метода состоит в том, чтобы предоставить физиологически актуальную модель ex vivo для изучения заживления ран у лиц с риском хронических ран, что позволит проводить транскриптомный анализ для дальнейшей идентификации новых терапевтических мишеней.

В настоящее время существует несколько моделей для изучения заживления ран, и каждая из них имеет свои сильные и слабые стороны. Широко используются животные модели in vivo, такие как мышь db/db² или крысы с диабетом³, вызванные стрептозотоцином; Тем не менее, раны на моделях грызунов заживают за счет сокращения, которое сильно отличается от механизма, используемого в человеческом организме, и имеют ограниченный успех в^{клинических испытаниях.} Преимущества использования человеческих тканей^{хорошо известны,} но они осложняются этичностью нанесения экспериментальных ран людям, у которых уже известно, что у них нарушена реакция заживления ран. Следовательно, исследования на людях с диабетом чаще всего направлены на воспалительную реакцию, а не на эксперименты на иссеченной^ткани. Также доступны модели Organ-on-a-Chip⁷ и искусственная кожа⁸. Их преимущество заключается в том, что они позволяют анализировать вклад клеток человека, но дают мало указаний на межпациентскую вариабельность. Таким образом, клинически значимые модели для изучения прогресса заживления ран в уязвимых группах пациентов могут ускорить механистическое понимание и открытие лекарств в этой области.

Протокол ранения ex vivo , описанный ниже, адаптирован из Stojadinovic and Tomic-Canic, 2013⁹. Он подходит для изучения транскрипционных данных контролируемого ранения образцов тканей человека ex vivo и может быть применен к клиническим образцам от пациентов с плохим заживлением ран (например, диабет 2 типа, пожилые люди) с целью расширения знаний о том, как влияет на заживление ран в этих условиях и потенциально как оно может быть восстановлено.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот протокол основан на предоставлении хирургической ткани человека. Перед началом эксперимента было получено этическое одобрение и информированное согласие пациента, и исследование соответствовало принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.

1. Забор тканей и нанесение ран ex vivo

1. Соберите хирургическую ткань после ампутации/операции конечности в стерильный контейнер, содержащий модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с 5% пенициллин-стрептомицин-фунгизона, 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; полная питательная среда).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собранную таким образом ткань можно хранить при температуре 4 °C до 24 часов до начала эксперимента. Чтобы обеспечить жизнеспособность ткани для экспериментов ex vivo , рекомендуется обрабатывать ткань как можно скорее или поддерживать фиксированный временной промежуток между сбором и ранением для стандартизации экспериментов по нескольким донорским тканям. Если ткань должна храниться в течение какого-либо периода времени, в образец следует добавить раствор для стабилизации РНК для поддержания целостности РНК.
2. С помощью стерильных щипцов перенести ткань в чашку Петри диаметром 60 мм, заполненную стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 5% пенициллин-стрептомицина-фунгизона. Срежьте жир с дермы с помощью стерильного скальпеля и/или хирургических ножниц и выбросьте. Переложите салфетку в свежую чашку Петри, наполненную стерильным ПБС.
3. Соедините два стерильных лезвия вместе таким образом, чтобы между ними был зазор в 1 мм. Разрежьте две параллельные линейные линии, расположенные на расстоянии ~1 мм друг от друга, по длине эпидермиса и верхней части сосочкового слоя дермы^10,11.
4. Удалите эпидермис между линиями надрезов с помощью стерильных щипцов и хирургических ножниц, чтобы создать линейную рану.
5. С помощью скальпеля разрежьте ткань на небольшие прямоугольники (максимальный размер 1 см² ), охватывающие рану с неповрежденным эпидермисом с обеих сторон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания целостности тканей и последующей РНК шаги 1.2-1.5 должны быть выполнены как можно быстрее.
6. Сделайте изображение раненой ткани с помощью микродиссекционного микроскопа с 4-кратным увеличением, чтобы поле зрения захватывало всю рану и окружающие неповрежденные эпидермальные ткани.
7. С помощью стерильных щипцов поместите тканевые прямоугольники на вкладыш для тканевых культур в 6-луночный планшет и аккуратно внесите в лунку 2 мл полной питательной среды. Это обеспечит культивирование образца на границе раздела жидкость-воздух.
8. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 на воздухе в течение 120 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна быть визуализирована на микродиссекционном микроскопе с тем же увеличением, что и на шаге 1.6, в конце инкубации. При необходимости снимки также могут быть сделаны каждые 24 часа.

2. Фиксация тканей и криосекция

1. Snap заморозьте ткань в жидком азоте. Поместите небольшое количество совместимого с криостатом режущего материала на патрон криостата и вставьте в него ткань. Ориентируйте ткань перпендикулярно лопаточной части так, чтобы режущая поверхность прорезала все слои кожи, включая раненый участок. Хранить при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
2. Очистите криостат при комнатной температуре с помощью 70% этанола и спрея для обеззараживания РНКазы. Установите температуру криостата на -28 °C.
3. Убедитесь, что ориентация патрона и лезвия криостата позволяет создавать участки, охватывающие всю толщину ткани, включая поврежденную ткань и нижележащую дерму.
4. С помощью криостата разрежьте до десяти срезов размером 7 мкм из каждой раны и поместите на предметные стекла для микродиссекции, не содержащие РНК.
5. Храните предметные стекла в оригинальной коробке, в которой были предоставлены предметные стекла для микродиссекций, при температуре -80 °C, чтобы обеспечить среду без РНКазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, но имейте в виду, что деградация РНК будет увеличиваться по мере увеличения времени хранения.

3. Микродиссекция лазерного захвата

1. Поместите предметные стекла с тканевым срезом в сухой лед и перейдите в комнату микродиссекционного микроскопа лазерного захвата.
2. Высушите^1-е предметное стекло на воздухе и быстро приступайте к окрашиванию срезов гематоксилином с использованием набора для окрашивания гематоксилином и эозином без РНКазы непосредственно перед выполнением микродиссекции лазерного захвата.
3. Визуализируйте раненую ткань с помощью микродиссекционного микроскопа с лазерным захватом при 10-кратном увеличении и сделайте снимок области интереса, которая будет захвачена лазером.
4. Проведите контур вокруг этой области (например, эпителиальный язык, грануляционная ткань, микрососуды) и соберите в микродиссекцию изолирующие колпачки диффузора объемом 0,5 мл, используя инструкции программного обеспечения для конкретного используемого микроскопа.
5. Повторно визуализируйте и визуализируйте область, захваченную лазером, с помощью микродиссекционного микроскопа с лазерным захватом при 10-кратном увеличении, чтобы продемонстрировать местоположение и полное иссечение рассекаемой ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте лазерный захват для каждого образца (до 10 срезов) в течение максимум 1 часа, чтобы свести к минимуму деградацию РНК.
6. Добавьте буфер для хранения РНК в пробирку, содержащую микрорассеченную ткань, в соответствии с инструкциями производителя и храните в сухом льду до тех пор, пока его нельзя будет перенести в морозильную камеру при температуре -80^°C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть временно приостановлен здесь.

4. Количественная оценка дифференциальной экспрессии генов

1. Центрифугируйте пробирки с образцами на полной скорости в течение 1 мин.
2. Изолируйте РНК из микродиссекированной ткани, следуя инструкциям производителя.
3. Разбавьте РНК в конечном объеме 12 мкл воды, свободной от РНКазы, и амплифицируйте РНК с помощью набора для амплификации РНК и термоамплификатора в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется провести два раунда амплификации, чтобы обеспечить достаточное количество РНК для дальнейшего анализа. Используйте условия усиления, приведенные в таблице 1.

Первый раунд усиления			Второй раунд ампликации
Синтез первой цепи			Синтез первой цепи
Шаг	Температура	Время	Шаг	Температура	Время
1	65 °C	5 мин	1	65 °C	5 мин
2	4 °C	держать	2	4 °C	держать
3	42 °C	45 мин	3	25 °С	10 мин
4	4 °C	держать	4	37 °C	45 мин
5	37 °C	20 мин	5	4 °C	держать
6	95 °C	5 мин
7	4 °C	держать	Синтез второй нити
			Шаг	Температура	Время
Синтез второй нити			1	95 °C	2 мин
Шаг	Температура	Время	2	4 °C	держать
1	95 °C	2 мин	3	37 °C	15
2	4 °C	держать	4	70 °C	5 мин
3	25 °С	5 мин	5	4 °C	держать
4	37 °C	10 мин
5	70 °C	5 мин	Транскрипция in vitro
6	4 °C	держать	Шаг	Температура	Время
			1	42 °C	6 ч
Транскрипция in vitro			2	4 °C	держать
Шаг	Температура	Время	3	37 °C	15 мин
1	42 °C	3 ч	4	4 °C	держать
2	4 °C	держать
3	37 °C	15 мин
4	4 °C	держать

Таблица 1: Условия усиления.

4. Количественно оцените концентрацию и чистоту амплифицированной РНК. Коэффициенты поглощения А260/230 (чистота) и А260/280 (загрязнения) > 1,8 подходят для дальнейшего анализа.
   Примечание: Очищенная амплифицированная РНК может быть использована для целенаправленных исследований экспрессии генов (шаги 4.5-4.6) или может быть отправлена для анализа микрочипов.
5. Синтезируйте кДНК с помощью высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Репрезентативные условия следующие:
   • 25 °C в течение 10 мин
   • 37 °C в течение 2 ч
   • 85 °C в течение 5 мин
   • Выдержка 4 °C
6. Количественную ПЦР проводят с использованием 0,5 мкл кДНК и 1 мкМ праймеров (интересующего гена) в соответствии с инструкциями производителя. Репрезентативные условия и последовательности праймеров выглядят следующим образом.
   1. Используйте следующие условия для количественных условий ПЦР: 95 °C в течение 10 минут; 40 циклов при температуре 95°C в течение 15 с и при 62°C в течение 1 мин; 95 °C в течение 5 мин; и держится при температуре 4°C.
   2. Используйте следующие последовательности праймеров:
      ГАПДХ
      Форвард 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Реверс 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      КРТ17
      Форвард 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Реверс 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Интерпретация данных

1. Рассчитайте скорость заживления ран с помощью изображений ткани ex vivo, полученных на шагах 1.6-1.8 с помощью ImageJ. В последнее время существует множество публикаций, в которых освещаются различные варианты автоматического анализа раневых участков в ImageJ 12,13,14.
2. Количественно оцените экспрессию генов с помощью метода ΔC_T , сравнивая пороговые циклы для интересующего гена с циклами домохозяйки (например, глицеральдегид-3-фосфат; GAPDH). Для этого обратите внимание на значение C_T для домохозяйки и для интересующего гена.
   1. Рассчитайте разницу между двумя значениями C_T , чтобы нормализовать количество присутствующей мРНК и контролировать различия в концентрациях экстракции РНК между различными изоляциями:
      ΔC_T = C_T (ген, представляющий интерес) - C_T (домохозяйка)
   2. Рассчитайте величину разницы между значениями C_T , чтобы получить относительную количественную оценку интересующего гена, выраженную в процентах от домохозяйки:
      Относительная количественная оценка = (^2-ΔCT) x 100
   3. Изучите различия между различными донорами пациентов/состояниями заболеваний, сравнивая относительные количественные оценки генов, представляющих интерес для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схему всей методики можно найти на рисунке 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В соответствии с протоколом для получения репрезентативных результатов была выбрана временная точка продолжительностью 48 часов. Создание начальной раны в избыточной ткани в результате плановой косметической хирургии можно увидеть на рисунке 2A , где...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

По мере того, как заболеваемость хроническими заболеваниями, такими как диабет 2 типа, растет во всем мире, потребность в методах, которые могут облегчить патофизиологически значимые исследования, становится все более актуальной. Описанный выше протокол представляет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix