Microdisección de captura láser en tejidos quirúrgicos para identificar la expresión génica aberrante en la cicatrización de heridas deterioradas en la diabetes tipo 2

Resumen

Esta técnica proporciona una guía para infligir heridas ex vivo , realizar microdisecciones de captura láser y cuantificar los cambios en la expresión génica relacionados con los procesos deficientes de cicatrización de heridas en la diabetes utilizando tejido humano clínicamente relevante.

Resumen

La prevalencia mundial de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) está aumentando a un ritmo acelerado. Los pacientes con DM2 sufren multitud de complicaciones y una de ellas es el deterioro de la cicatrización de las heridas. Esto puede conducir al desarrollo de llagas que no cicatrizan o úlceras en los pies y, en última instancia, a la amputación. En individuos sanos, la cicatrización de heridas sigue una secuencia controlada y superpuesta de eventos que abarcan la inflamación, la proliferación y la remodelación. En la DM2, uno o más de estos pasos se vuelven disfuncionales. Los modelos actuales para estudiar el deterioro de la cicatrización de heridas en la DM2 incluyen ensayos de heridas por rasguño in vitro, equivalentes cutáneos o modelos animales para examinar los mecanismos moleculares que sustentan la cicatrización de heridas y/o las posibles opciones terapéuticas. Sin embargo, estos no recapitulan completamente el complejo proceso de cicatrización de heridas en pacientes con DM2, y las pruebas de piel humana ex vivo son problemáticas debido a la ética de tomar biopsias en sacabocados de pacientes donde se sabe que sanarán mal. Aquí, se describe una técnica mediante la cual los perfiles de expresión de las células específicas involucradas en la respuesta de cicatrización de heridas (dis)funcionales en pacientes con DM2 se pueden examinar utilizando el tejido excedente descartado después de una amputación o cirugía estética electiva. En este protocolo se recogen muestras de piel donada, heridas, cultivadas ex vivo en la interfaz aire-líquido, fijadas en diferentes puntos temporales y seccionadas. Los tipos específicos de células implicadas en la cicatrización de heridas (por ejemplo, queratinocitos epidérmicos, fibroblastos dérmicos (papilares y reticulares), la vasculatura) se aíslan mediante microdisección de captura láser y las diferencias en la expresión génica se analizan mediante secuenciación o microarray, con genes de interés validados aún más por qPCR. Este protocolo se puede utilizar para identificar diferencias inherentes en la expresión génica entre la piel intacta y la que cicatriza mal, en pacientes con o sin diabetes, utilizando tejido que normalmente se desecha después de la cirugía. Permitirá comprender mejor los mecanismos moleculares que contribuyen a las heridas crónicas de la DM2 y a la pérdida de extremidades inferiores.

Introducción

La incidencia de la diabetes tipo 2 está creciendo en todo el mundo, impulsada por una epidemia de obesidad e inactividad física. La mala cicatrización de las heridas es común en estos pacientes y hasta el 25% de los pacientes desarrollarán una herida crónica que no cicatriza¹. Los mecanismos que subyacen a esto son complejos y no se comprenden completamente, lo que limita la tasa de descubrimiento de nuevas terapias. Uno de los factores que contribuyen a esto es la falta de un modelo adecuado para estudiar la cicatrización de heridas en pacientes con diabetes tipo 2. Por lo tanto, el propósito de este método es proporcionar un modelo ex vivo fisiológicamente relevante para examinar la cicatrización de heridas en aquellos con riesgo de heridas crónicas, lo que permite el análisis transcriptómico para avanzar en la identificación de nuevas dianas terapéuticas.

Actualmente hay varios modelos disponibles para estudiar la cicatrización de heridas, y cada uno tiene sus fortalezas y debilidades. Los modelos animales in vivo, como el ratón db/db² o las ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina³ son ampliamente utilizados; Sin embargo, las heridas en modelos de roedores cicatrizan a través de la contracción, que es muy diferente al mecanismo empleado en el cuerpo humano, y tienen un éxito limitado en la traducción a ensayos clínicos ^4,5. Los beneficios del uso de tejido humano son^{bien reconocidos}, pero se complican por la ética de infligir heridas experimentales a individuos que ya se sabe que tienen una respuesta de cicatrización de heridas deteriorada. En consecuencia, los estudios en sujetos humanos con diabetes se dirigen más comúnmente hacia la respuesta inflamatoria que hacia la experimentación con tejido extirpado⁶. También están disponibles los modelos Organ-on-a-chip⁷ y de piel artificial⁸. Estos tienen la ventaja de poder analizar las contribuciones de las células humanas, pero dan poca indicación de la variabilidad entre pacientes. Por lo tanto, los modelos clínicamente relevantes para estudiar el progreso de la cicatrización de heridas en poblaciones de pacientes vulnerables podrían acelerar la comprensión mecanicista y el descubrimiento de fármacos en esta área.

El protocolo de herida ex vivo que se describe a continuación es una adaptación de Stojadinovic y Tomic-Canic, 2013⁹. Es adecuado para examinar datos transcripcionales de heridas controladas de muestras de tejido humano ex vivo y se puede aplicar a muestras clínicas de pacientes con mala cicatrización de heridas (por ejemplo, diabetes tipo 2, personas mayores), con el fin de avanzar en el conocimiento sobre cómo se ve afectada la cicatrización de heridas en estas condiciones y, potencialmente, cómo se puede restaurar.

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Protocolo

Este protocolo se basa en el suministro de tejido quirúrgico humano. Se obtuvo la aprobación ética y el consentimiento informado del paciente antes de la experimentación, y el estudio se ajustó a los principios descritos en la Declaración de Helsinki.

1. Recolección de tejido y heridas ex vivo

1. Recoja el tejido quirúrgico después de la amputación/cirugía de una extremidad en un recipiente estéril que contenga el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 5% de penicilina-estreptomicina-fungizona, 2 mM de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS; medio de crecimiento completo).
   NOTA: El tejido recolectado de esta manera puede almacenarse a 4 °C hasta 24 horas antes de la experimentación. Para garantizar la viabilidad del tejido para experimentos ex vivo , se recomienda procesar el tejido lo antes posible o mantener un intervalo de tiempo fijo entre la recolección y la herida para estandarizar los experimentos en múltiples donaciones de tejido. Si el tejido se va a almacenar durante cualquier cantidad de tiempo, se debe agregar una solución de estabilización de ARN a la muestra para mantener la integridad del ARN.
2. Con pinzas estériles, transfiera el tejido a una placa de Petri de 60 mm llena de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) suplementada con un 5% de penicilina-estreptomicina-hongo. Recorte la grasa de la dermis con un bisturí estéril y/o unas tijeras quirúrgicas y deséchela. Transfiera el pañuelo a una placa de Petri fresca llena de PBS estéril.
3. Coloque dos cuchillas estériles juntas de manera que haya un espacio de 1 mm entre las dos cuchillas. Marque dos líneas lineales paralelas, separadas por ~ 1 mm, a lo largo de la epidermis y la parte superior de la dermis papilar^10,11.
4. Retire la epidermis entre las líneas de puntuación con pinzas estériles y tijeras quirúrgicas para crear una herida lineal.
5. Utilice un bisturí para cortar el tejido en pequeños rectángulos (tamaño máximo de 1 cm²) que rodeen la herida con la epidermis intacta a ambos lados.
   NOTA: Para mantener la integridad del tejido y el ARN posterior, los pasos 1.2-1.5 deben realizarse lo más rápido posible.
6. Tome una imagen del tejido herido con un microscopio de microdisección con un aumento de 4x, asegurando que el campo de visión capture la totalidad de la herida y el tejido epidérmico intacto circundante.
7. Con pinzas estériles, coloque los rectángulos de tejido en un inserto de cultivo de tejidos en una placa de 6 pocillos y pipetee suavemente 2 mL de medio de crecimiento completo en el pocillo. Esto asegurará que la muestra se cultive en la interfaz líquido-aire.
8. Incubar a 37 °C en 5% de CO₂ en el aire durante un máximo de 120 h.
   NOTA: El tejido debe ser visualizado en un microscopio de microdisección con el mismo aumento que en el paso 1.6 al final de la incubación. También se pueden tomar imágenes cada 24 h si es necesario.

2. Fijación de tejidos y criosección

1. Congele el tejido en nitrógeno líquido. Coloque una pequeña cantidad de medio de corte compatible con criostato en un mandril de criostato e incruste el tejido dentro de él. Oriente el tejido perpendicular al mandril de modo que la cara de corte corte corte todas las capas de la piel, incluida la zona herida. Conservar a -80 °C.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Limpie el criostato a temperatura ambiente con un spray de descontaminación de etanol y RNasa al 70%. Ajuste la temperatura del criostato a -28 °C.
3. Compruebe que la orientación del mandril y de la cuchilla del criostato pueda producir secciones que abarquen todo el espesor del tejido, incluido el tejido herido y la dermis subyacente.
4. Con el criostato, corte hasta diez secciones de 7 μm de cada herida y colóquelas en portaobjetos de microdisección sin ARN.
5. Guarde los portaobjetos en la caja original en la que se proporcionaron los portaobjetos de microdisección a -80 °C para garantizar un entorno libre de ARNasa.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, pero tenga en cuenta que la degradación del ARN aumentará cuanto mayor sea el tiempo de almacenamiento.

3. Microdisección por captura láser

1. Coloque los portaobjetos de microdisección con la sección de tejido en hielo seco y vaya a la sala de microscopio de microdisección de captura láser.
2. Seque al aire la^1ª diapositiva y proceda rápidamente a teñir las secciones con hematoxilina utilizando un kit de tinción de hematoxilina y eosina sin RNasa inmediatamente antes de realizar la microdisección por captura láser.
3. Visualice el tejido herido utilizando un microscopio de microdisección de captura láser con un aumento de 10x y tome una fotografía del área de interés que se capturará con láser.
4. Traza alrededor de esa área (por ejemplo, lengua epitelial, tejido de granulación, microvasos) y recoja en tapas de aislamiento de difusor de microdisección de 0,5 ml utilizando las instrucciones del software para el microscopio particular que se está utilizando.
5. Vuelva a visualizar e obtener imágenes del área de interés capturada por láser utilizando el microscopio de microdisección de captura láser con un aumento de 10x para demostrar la ubicación y la escisión completa del tejido disecado.
   NOTA: Realice la captura láser de cada muestra (hasta 10 secciones) durante un tiempo máximo de 1 h para minimizar la degradación del ARN.
6. Agregue tampón de almacenamiento de ARN al tubo que contiene el tejido microdisecado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacene en hielo seco hasta que pueda transferirse a un congelador a -80 ^° C.
   NOTA: El protocolo se puede pausar temporalmente aquí.

4. Cuantificación de la expresión génica diferencial

1. Centrifugar los tubos de muestra a toda velocidad durante 1 min.
2. Aísle el ARN del tejido microdisecado siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Eluir el ARN en un volumen final de 12 μL de agua libre de ARNasa y amplificar el ARN utilizando un kit de amplificación de ARN y un termociclador, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recomiendan dos rondas de amplificación para garantizar que haya suficiente ARN para un análisis posterior. Utilice las condiciones de amplificación de la Tabla 1.

Primera ronda de amplificación			Segunda ronda de amplificación
Síntesis de la primera hebra			Síntesis de la primera hebra
Paso	Temperatura	Hora	Paso	Temperatura	Hora
1	65 °C	5 minutos	1	65 °C	5 minutos
2	4 °C	sostener	2	4 °C	sostener
3	42 °C	45 minutos	3	25 °C	10 minutos
4	4 °C	sostener	4	37 °C	45 minutos
5	37 °C	20 minutos	5	4 °C	sostener
6	95 °C	5 minutos
7	4 °C	sostener	Síntesis de la segunda hebra
			Paso	Temperatura	Hora
Síntesis de la segunda hebra			1	95 °C	2 minutos
Paso	Temperatura	Hora	2	4 °C	sostener
1	95 °C	2 minutos	3	37 °C	15
2	4 °C	sostener	4	70 °C	5 minutos
3	25 °C	5 minutos	5	4 °C	sostener
4	37 °C	10 minutos
5	70 °C	5 minutos	Transcripción in vitro
6	4 °C	sostener	Paso	Temperatura	Hora
			1	42 °C	6 h
Transcripción in vitro			2	4 °C	sostener
Paso	Temperatura	Hora	3	37 °C	15 minutos
1	42 °C	3 h	4	4 °C	sostener
2	4 °C	sostener
3	37 °C	15 minutos
4	4 °C	sostener

Tabla 1: Condiciones de amplificación.

4. Cuantificar la concentración y pureza del ARN amplificado. Las relaciones de absorbancia de A260/230 (pureza) y A260/280 (contaminantes) > 1,8 son adecuadas para un análisis posterior.
   NOTA: El ARN amplificado purificado se puede utilizar para estudios de expresión génica focalizados (pasos 4.5-4.6) o se puede enviar para el análisis de microarrays.
5. Sintetice ADNc utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones representativas son las siguientes:
   • 25 °C durante 10 min
   • 37 °C durante 2 h
   • 85 °C durante 5 min
   • Retención a 4 °C
6. Realice una PCR cuantitativa utilizando 0,5 μL de ADNc y 1 μM de cebadores (del gen de interés) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones representativas y las secuencias de cebadores son las siguientes.
   1. Utilice las siguientes condiciones para condiciones cuantitativas de PCR: 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 62 °C durante 1 min; 95 °C durante 5 min; y 4°C de retención.
   2. Utilice las siguientes secuencias de cebadores:
      GAPDH
      Delantero 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Reverso 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Delantero 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Reverso 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interpretación de los datos

1. Calcule la tasa de cicatrización de heridas utilizando las imágenes del tejido ex vivo generadas en los pasos 1.6-1.8 utilizando ImageJ. Hay varias publicaciones recientes que destacan diferentes variaciones sobre cómo analizar automáticamente las áreas de la herida en ImageJ 12,13,14.
2. Cuantificar la expresión génica mediante el método ΔC_T , comparando los ciclos umbral para el gen de interés en comparación con el del ama de llaves (por ejemplo, gliceraldehído-3-fosfato; GAPDH). Para hacer esto, anote el valor C_T para el ama de llaves y para el gen de interés.
   1. _Calcule la diferencia entre los dos valores de C T para normalizar la cantidad de ARNm presente y controlar las diferencias en las concentraciones de extracción de ARN entre diferentes aislamientos:
      ΔC_T = C_T (gen de interés) - C_T (ama de llaves)
   2. Calcule la magnitud de la diferencia entre los valores de C_T para obtener la cuantificación relativa del gen de interés, expresado como un porcentaje del ama de llaves:
      Cuantificación relativa = (^2-ΔCT) x 100
   3. Examinar las diferencias entre los diferentes pacientes donantes/estados de la enfermedad comparando las cuantificaciones relativas de los genes de interés para cada muestra.
      NOTA: En la Figura 1 se puede encontrar un esquema de toda la técnica.

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Resultados

Siguiendo el protocolo, se eligió un punto de tiempo de 48 h para generar resultados representativos. La creación de la herida inicial en el tejido sobrante de la cirugía estética electiva se puede ver en la Figura 2A , donde la herida extirpada es claramente visible. La tinción con hematoxilina y eosina confirma que se ha generado una herida de espesor completo (Figura 2B). Después de 48 h, el cierre parcial de la herida ...

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Discusión

A medida que la incidencia de trastornos crónicos como la diabetes tipo 2 aumenta a nivel mundial, la necesidad de técnicas que puedan facilitar estudios fisiopatológicamente relevantes se vuelve más urgente. El protocolo descrito anteriormente proporciona un método estandarizado para examinar los datos transcriptómicos de heridas en cicatrización ex vivo utilizando tejido humano.

Este protocolo depende del suministro de tejido clínico exceden...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix