Laser-Capture-Mikrodissektion an chirurgischem Gewebe zur Identifizierung einer aberranten Genexpression bei gestörter Wundheilung bei Typ-2-Diabetes

Zusammenfassung

Diese Technik bietet einen Leitfaden für das Zufügen von ex vivo-Wunden , die Durchführung von Laser-Capture-Mikrodissektionen und die Quantifizierung von Veränderungen der Genexpression im Zusammenhang mit schlechten Wundheilungsprozessen bei Diabetes unter Verwendung von klinisch relevantem menschlichem Gewebe.

Zusammenfassung

Die weltweite Prävalenz von Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) nimmt rasant zu. Patienten mit T2DM leiden unter einer Vielzahl von Komplikationen, eine davon ist eine gestörte Wundheilung. Dies kann zur Entstehung von nicht heilenden Wunden oder Fußgeschwüren und schließlich zur Amputation führen. Bei gesunden Menschen folgt die Wundheilung einer kontrollierten und sich überschneidenden Abfolge von Ereignissen, die Entzündungen, Proliferation und Umbau umfassen. In T2DM wird einer oder mehrere dieser Schritte dysfunktional. Zu den aktuellen Modellen zur Untersuchung der gestörten Wundheilung bei T2DM gehören in vitro Scratch-Wund-Assays, Hautäquivalente oder Tiermodelle, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Wundheilung zugrunde liegen, und/oder potenzielle therapeutische Optionen. Diese rekapitulieren jedoch den komplexen Wundheilungsprozess bei T2DM-Patienten nicht vollständig, und Ex-vivo-Tests an der menschlichen Haut sind problematisch, da es ethisch ist, Stanzbiopsien von Patienten zu entnehmen, von denen bekannt ist, dass sie schlecht heilen. In dieser Arbeit wird eine Technik beschrieben, mit der Expressionsprofile der spezifischen Zellen, die an der (dys)funktionellen Wundheilungsreaktion bei T2DM-Patienten beteiligt sind, anhand von überschüssigem Gewebe untersucht werden können, das nach einer Amputation oder elektiven kosmetischen Operation entsorgt wurde. In diesem Protokoll werden Proben von gespendeter Haut entnommen, verwundet, ex vivo in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert, zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert und geschnitten. Spezifische Zelltypen, die an der Wundheilung beteiligt sind (z. B. epidermale Keratinozyten, dermale Fibroblasten (papillär und retikulär), das Gefäßsystem) werden mittels Laser-Capture-Mikrodissektion isoliert und Unterschiede in der Genexpression durch Sequenzierung oder Microarray analysiert, wobei die interessierenden Gene durch qPCR weiter validiert werden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um inhärente Unterschiede in der Genexpression zwischen schlecht heilender und intakter Haut bei Patienten mit oder ohne Diabetes zu identifizieren, wobei Gewebe verwendet wird, das normalerweise nach einer Operation verworfen wird. Es wird zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die zu chronischen T2DM-Wunden und dem Verlust der unteren Gliedmaßen beitragen.

Einleitung

Die Inzidenz von Typ-2-Diabetes nimmt weltweit zu, angetrieben durch eine Adipositas-Epidemie und Bewegungsmangel. Eine schlechte Wundheilung ist bei diesen Patienten häufig und bis zu 25 % der Patienten entwickeln eine chronische, nicht heilende^{Wunde 1}. Die Mechanismen, die dem zugrunde liegen, sind komplex und unvollständig verstanden, was die Entdeckungsrate für neue Therapeutika einschränkt. Einer der Faktoren, die dazu beitragen, ist das Fehlen eines geeigneten Modells zur Untersuchung der Wundheilung bei Typ-2-Diabetes-Patienten. Der Zweck dieser Methode besteht daher darin, ein physiologisch relevantes ex vivo-Modell zur Untersuchung der Wundheilung bei Menschen mit einem Risiko für chronische Wunden bereitzustellen, das eine transkriptomische Analyse ermöglicht, um die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele voranzutreiben.

Es gibt derzeit mehrere Modelle, um die Wundheilung zu untersuchen, und jedes hat seine Stärken und Schwächen. In-vivo-Tiermodelle wie die db/db-Maus² oder Streptozotocin-induzierte diabetische Ratten³ sind weit verbreitet; Wunden in Nagetiermodellen heilen jedoch durch Kontraktion, was sich stark von dem im menschlichen Körper angewandten Mechanismus unterscheidet und bei der Übertragung auf klinische Studien nur begrenzten Erfolg hat ^4,5. Die Vorteile der Verwendung von menschlichem Gewebe sind allgemein anerkannt⁴, werden jedoch durch die Ethik des Zufügens experimenteller Wunden bei Personen erschwert, von denen bereits bekannt ist, dass sie eine beeinträchtigte Wundheilungsreaktion aufweisen. Folglich richten sich Studien an Menschen mit Diabetes häufiger auf die Entzündungsreaktion als auf Experimente an exzidiertem Gewebe⁶. Organ-on-a-Chip⁷ und künstliche Haut^{Modelle 8} sind ebenfalls erhältlich. Diese haben den Vorteil, dass sie in der Lage sind, menschliche Zellbeiträge zu analysieren, geben aber nur wenige Hinweise auf die Variabilität zwischen den Patienten. Klinisch relevante Modelle zur Untersuchung des Fortschritts der Wundheilung in vulnerablen Patientenpopulationen könnten daher das mechanistische Verständnis und die Wirkstoffforschung in diesem Bereich beschleunigen.

Das im Folgenden beschriebene Ex-vivo-Verletzungsprotokoll wurde von Stojadinovic und Tomic-Canic, 2013⁹ übernommen. Es eignet sich für die Untersuchung von Transkriptionsdaten aus kontrollierter Verwundung menschlicher Gewebeproben ex vivo und kann auf klinische Proben von Patienten mit schlechter Wundheilung (z. B. Typ-2-Diabetes, ältere Menschen) angewendet werden, um das Wissen darüber zu erweitern, wie die Wundheilung unter diesen Bedingungen beeinflusst wird und wie sie möglicherweise wiederhergestellt werden kann.

Protokoll

Dieses Protokoll beruht auf der Bereitstellung von menschlichem chirurgischem Gewebe. Vor dem Experiment wurden die ethische Genehmigung und die Einwilligung der Patienten nach Aufklärung eingeholt, und die Studie entsprach den in der Deklaration von Helsinki dargelegten Prinzipien.

1. Entnahme von Gewebe und Ex-vivo-Verwundung

1. Chirurgisches Gewebe nach einer Amputation/Operation der Gliedmaßen in einem sterilen Behälter sammeln, der Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 5 % Penicillin-Streptomycin-Fungizon, 2 mM L-Glutamin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS; vollständiges Wachstumsmedium) enthält.
   HINWEIS: Auf diese Weise entnommenes Gewebe kann vor dem Versuch bis zu 24 Stunden lang bei 4 °C gelagert werden. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes für Ex-vivo-Experimente zu gewährleisten, wird empfohlen, das Gewebe so schnell wie möglich zu verarbeiten oder einen festen Zeitabstand zwischen Entnahme und Verwundung einzuhalten, um Experimente über mehrere Gewebespenden hinweg zu standardisieren. Wenn das Gewebe über einen längeren Zeitraum gelagert werden soll, sollte der Probe eine RNA-Stabilisierungslösung zugesetzt werden, um die RNA-Integrität zu erhalten.
2. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette in eine 60-mm-Petrischale, die mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, die mit 5 % Penicillin-Streptomycin-Pilzzone ergänzt wird. Schneiden Sie das Fett mit einem sterilen Skalpell und/oder einer chirurgischen Schere von der Dermis ab und entsorgen Sie es. Übertragen Sie das Taschentuch in eine frische Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
3. Befestigen Sie zwei sterile Klingen so, dass zwischen den beiden Klingen ein Abstand von 1 mm entsteht. Es werden zwei parallele lineare Linien im Abstand von ~1 mm über die Länge der Epidermis und den oberen Teil der papillären Dermis^10,11 geritzt.
4. Entfernen Sie die Epidermis zwischen den Kerben mit einer sterilen Pinzette und einer chirurgischen Schere, um eine lineare Wunde zu erzeugen.
5. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in kleine Rechtecke (maximale Größe von 1 cm²), die die Wunde mit intakter Epidermis auf beiden Seiten umgeben.
   HINWEIS: Um die Integrität des Gewebes und der nachfolgenden RNA zu erhalten, sollten die Schritte 1.2-1.5 so schnell wie möglich durchgeführt werden.
6. Nehmen Sie mit einem Mikrodissektionsmikroskop bei 4-facher Vergrößerung ein Bild des verwundeten Gewebes auf und stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld die gesamte Wunde und das umgebende intakte Epidermisgewebe erfasst.
7. Legen Sie die Geweberechtecke mit einer sterilen Pinzette auf einen Gewebekultureinsatz in einer 6-Well-Platte und pipettieren Sie vorsichtig 2 ml vollständiges Wachstumsmedium in die Vertiefung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe an der Flüssig-Luft-Grenzfläche kultiviert wird.
8. Bei 37 °C in 5 % CO₂ an der Luft bis zu 120 h inkubieren.
   HINWEIS: Das Gewebe sollte am Ende der Inkubation auf einem Mikrodissektionsmikroskop in der gleichen Vergrößerung wie in Schritt 1.6 abgebildet werden. Bei Bedarf können auch alle 24 h Bilder aufgenommen werden.

2. Gewebefixierung und Kryosektion

1. Frieren Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff ein. Geben Sie eine kleine Menge kryostatfähiges Schneidmedium auf ein Kryostatfutter und betten Sie das Gewebe darin ein. Richten Sie das Gewebe senkrecht zum Spannfutter aus, so dass die Schneidfläche alle Hautschichten einschließlich des verwundeten Bereichs durchschneidet. Bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
2. Reinigen Sie den Kryostaten bei Raumtemperatur mit 70%igem Ethanol und RNase-Dekontaminationsspray. Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -28 °C ein.
3. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung des Spannfutters und der Kryostatklinge Schnitte erzeugen kann, die die gesamte Dicke des Gewebes umfassen, einschließlich des verwundeten Gewebes und der darunter liegenden Dermis.
4. Mit dem Kryostaten werden aus jeder Wunde bis zu zehn 7 μm große Schnitte geschnitten und auf RNA-freie Mikrodissektionspräparate gelegt.
5. Lagern Sie die Objektträger in der Originalverpackung, in der die Objektträger für Mikrodissektionen bereitgestellt wurden, bei -80 °C, um eine RNase-freie Umgebung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, aber beachten Sie, dass der RNA-Abbau zunimmt, je länger die Lagerzeit ist.

3. Laser-Capture-Mikrodissektion

1. Legen Sie die Objektträger der Mikrodissektion mit dem Gewebeschnitt in Trockeneis und begeben Sie sich in den Raum für das Mikrodissektionsmikroskop mit Laseraufnahme.
2. Trocknen Sie den 1^{. Objektträger} an der Luft und färben Sie die Schnitte unmittelbar vor der Durchführung der Laser-Capture-Mikrodissektion schnell mit Hämatoxylin mit einem RNase-freien Hämatoxylin- und Eosin-Färbekit.
3. Visualisieren Sie das verletzte Gewebe mit einem Laser-Capture-Mikrodissektionsmikroskop bei 10-facher Vergrößerung und machen Sie ein Bild des interessierenden Bereichs, der mit dem Laser erfasst wird.
4. Verfolgen Sie diesen Bereich (z. B. Epithelzunge, Granulationsgewebe, Mikrogefäße) und sammeln Sie 0,5 ml Diffusor-Isolationskappen in der Mikrodissektion, indem Sie die Softwareanweisungen für das jeweilige Mikroskop verwenden.
5. Visualisieren und abbilden Sie den vom Laser erfassten Interessenbereich mit dem Laser-Capture-Mikrodissektionsmikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um die Position und vollständige Exzision des präparierten Gewebes zu demonstrieren.
   HINWEIS: Führen Sie die Lasererfassung für jede Probe (bis zu 10 Abschnitte) für eine maximale Zeit von 1 h durch, um den RNA-Abbau zu minimieren.
6. Geben Sie RNA-Speicherpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Röhrchen mit dem mikropräparierten Gewebe und lagern Sie es in Trockeneis, bis es in einen -80 ^°C-Gefrierschrank überführt werden kann.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier vorübergehend pausiert werden.

4. Quantifizierung der differentiellen Genexpression

1. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei voller Geschwindigkeit für 1 min.
2. Isolieren Sie RNA aus dem mikropräparierten Gewebe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Eluieren Sie die RNA in einem Endvolumen von 12 μl RNase-freiem Wasser und amplifizieren Sie die RNA mit einem RNA-Amplifikationskit und einem Thermocycler gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es werden zwei Amplifikationsrunden empfohlen, um sicherzustellen, dass genügend RNA für die weitere Analyse zur Verfügung steht. Verwenden Sie die Amplifikationsbedingungen in Tabelle 1.

Erste Verstärkungsrunde			Zweite Amplikationsrunde
Erste Strangsynthese			Erste Strangsynthese
Schritt	Temperatur	Zeit	Schritt	Temperatur	Zeit
1	65 °C	5 Minuten	1	65 °C	5 Minuten
2	4 °C	halten	2	4 °C	halten
3	42 °C	45 Minuten	3	25 °C	ca. 10 Minuten
4	4 °C	halten	4	37 °C	45 Minuten
5	37 °C	ca. 20 Minuten	5	4 °C	halten
6	95 °C	5 Minuten
7	4 °C	halten	Synthese des zweiten Strangs
			Schritt	Temperatur	Zeit
Synthese des zweiten Strangs			1	95 °C	2 Minuten
Schritt	Temperatur	Zeit	2	4 °C	halten
1	95 °C	2 Minuten	3	37 °C	15
2	4 °C	halten	4	70 °C	5 Minuten
3	25 °C	5 Minuten	5	4 °C	halten
4	37 °C	ca. 10 Minuten
5	70 °C	5 Minuten	In-vitro-Transkription
6	4 °C	halten	Schritt	Temperatur	Zeit
			1	42 °C	6 h
In-vitro-Transkription			2	4 °C	halten
Schritt	Temperatur	Zeit	3	37 °C	15 Minuten
1	42 °C	3 h	4	4 °C	halten
2	4 °C	halten
3	37 °C	15 Minuten
4	4 °C	halten

Tabelle 1: Amplifikationsbedingungen.

4. Quantifizieren Sie die Konzentration und Reinheit der amplifizierten RNA. Für die weitere Analyse eignen sich Absorptionsverhältnisse von A260/230 (Reinheit) und A260/280 (Kontaminanten) > 1,8.
   HINWEIS: Aufgereinigte amplifizierte RNA kann für fokussierte Genexpressionsstudien (Schritte 4.5-4.6) verwendet oder zur Microarray-Analyse eingesandt werden.
5. Synthetisieren Sie cDNA mit einem hochleistungsfähigen cDNA-Reverse-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Repräsentative Bedingungen sind wie folgt:
   • 25 °C für 10 min
   • 37 °C für 2 h
   • 85 °C für 5 min
   • 4 °C halten
6. Führen Sie eine quantitative PCR mit 0,5 μl cDNA und 1 μM Primern (des Gens von Interesse) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Repräsentative Bedingungen und Primersequenzen sind wie folgt.
   1. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen für quantitative PCR-Bedingungen: 95 °C für 10 Minuten; 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 62 °C für 1 min; 95 °C für 5 min; und 4°C halten.
   2. Verwenden Sie die folgenden Primer-Sequenzen:
      GAPDH
      Vorwärts 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Rückwärts 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Vorwärts 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Rückwärts 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interpretation der Daten

1. Berechnen Sie die Wundheilungsrate anhand der Bilder des ex vivo-Gewebes, die in den Schritten 1.6-1.8 mit ImageJ erzeugt wurden. Es gibt mehrere neuere Publikationen, die verschiedene Variationen der automatischen Analyse von Wundbereichen in ImageJ 12,13,14 hervorheben.
2. Quantifizieren Sie die Genexpression unter Verwendung der ΔC_T-Methode , indem Sie die Schwellenwertzyklen für das interessierende Gen mit dem der Haushälterin vergleichen (z. B. Glycerinaldehyd-3-phosphat; GAPDH). Notieren Sie sich dazu_{den CT-Wert} für die Haushälterin und für das interessierende Gen.
   1. Berechnen Sie die Differenz zwischen den_{beiden CT-Werten} , um die Menge der vorhandenen mRNA zu normalisieren und Unterschiede in den RNA-Extraktionskonzentrationen zwischen verschiedenen Isolierungen zu kontrollieren:
      ΔC_T = C_T (Gen von Interesse) - C_T (Haushälterin)
   2. Berechnen Sie die Größe der Differenz zwischen_{den CT-Werten} , um die relative Quantifizierung des interessierenden Gens zu erhalten, ausgedrückt als Prozentsatz der Haushälterin:
      Relative Quantifizierung = (^2-ΔCT) x 100
   3. Untersuchen Sie Unterschiede zwischen verschiedenen Patientenspendern/Krankheitszuständen, indem Sie die relativen Quantifizierungen der interessierenden Gene für jede Probe vergleichen.
      HINWEIS: Ein Schema der gesamten Technik finden Sie in Abbildung 1.

Ergebnisse

Dem Protokoll folgend wurde ein 48-Stunden-Zeitpunkt gewählt, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen. Die Entstehung der anfänglichen Wunde in überschüssigem Gewebe aus elektiven kosmetischen Eingriffen ist in Abbildung 2A zu sehen, wo die herausgeschnittene Wunde deutlich sichtbar ist. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen bestätigen, dass dadurch eine Wunde in voller Dicke entstanden ist (Abbildung 2B). Nach 48 h ist ein ...

Diskussion

Da die Inzidenz chronischer Erkrankungen wie Typ-2-Diabetes weltweit zunimmt, wird der Bedarf an Techniken, die pathophysiologisch relevante Studien erleichtern können, immer dringlicher. Das oben beschriebene Protokoll bietet ein standardisiertes Verfahren zur Untersuchung von transkriptomischen Daten aus ex vivo heilenden Wunden unter Verwendung von menschlichem Gewebe.

Dieses Protokoll ist abhängig von der Bereitstellung von überschüssigem klin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix