לכידת מיקרו-דיסקציה בלייזר על רקמות כירורגיות לזיהוי ביטוי גנים חריג בריפוי פצעים לקוי בסוכרת מסוג 2

Summary

טכניקה זו מספקת מדריך לגרימת פצעים מחוץ לגוף , ביצוע מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר וכימות שינויים בביטוי גנים הקשורים לתהליכי ריפוי פצעים לקויים בסוכרת באמצעות רקמה אנושית רלוונטית קלינית.

Abstract

השכיחות העולמית של סוכרת מסוג 2 (T2DM) עולה בקצב מהיר. חולים עם סוכרת מסוג 2 סובלים ממספר רב של סיבוכים ואחד מהם הוא פגיעה בריפוי פצעים. זה יכול להוביל להתפתחות פצעים או כיבים בכף הרגל שאינם נרפאים ובסופו של דבר לקטיעה. אצל אנשים בריאים, ריפוי פצעים עוקב אחר רצף מבוקר וחופף של אירועים הכוללים דלקת, התפשטות ועיצוב מחדש. בסוכרת מסוג 2, אחד או יותר מהשלבים הללו הופך לבלתי מתפקד. המודלים הנוכחיים לחקר פגיעה בריפוי פצעים בסוכרת מסוג 2 כוללים בדיקות פצע שריטות במבחנה, מקבילות עור או מודלים של בעלי חיים לבחינת מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס ריפוי פצעים ו/או אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, אלה אינם מסכמים במלואם את תהליך ריפוי הפצעים המורכב בחולי סוכרת מסוג 2, ובדיקות עור אנושיות ex vivo הן בעייתיות בשל האתיקה של לקיחת ביופסיות אגרוף ממטופלים שבהם ידוע שהם יחלימו בצורה גרועה. כאן, מתוארת טכניקה לפיה ניתן לבחון פרופילי ביטוי של התאים הספציפיים המעורבים בתגובת ריפוי הפצע (הלקויה) התפקודית בחולי T2DM באמצעות רקמות עודפות שהושלכו לאחר קטיעה או ניתוח קוסמטי אלקטיבי. בפרוטוקול זה נאספות דגימות של עור שנתרם, פצועות, מתורבתות ex vivo בממשק נוזל האוויר, מקובעות בנקודות זמן שונות ונחתכות. סוגי תאים ספציפיים המעורבים בריפוי פצעים (למשל, קרטינוציטים אפידרמיסיים, פיברובלסטים עוריים (פפילרי ורשתית), כלי הדם) מבודדים באמצעות לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה והבדלים בביטוי גנים המנותחים על ידי ריצוף או מיקרו-מערך, עם גנים מעניינים מאומתים עוד יותר על ידי qPCR. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הבדלים מובנים בביטוי הגנים בין עור שהחלים בצורה גרועה ועור שלם, בחולים עם או בלי סוכרת, באמצעות רקמות שהושלכו בדרך כלל לאחר ניתוח. זה יניב הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים התורמים לפצעים כרוניים של T2DM ואובדן גפיים תחתונות.

Introduction

שכיחות סוכרת מסוג 2 גדלה ברחבי העולם, מונעת על ידי מגיפת השמנת יתר וחוסר פעילות גופנית. ריפוי פצעים לקוי שכיח בחולים אלה ועד 25% מהחולים יפתחו פצע כרוני שאינו מרפא¹. המנגנונים העומדים בבסיס זה מורכבים ולא מובנים לחלוטין, ומגבילים את קצב הגילוי של טיפולים חדשים. אחד הגורמים התורמים לכך הוא היעדר מודל מתאים לחקר ריפוי פצעים בחולי סוכרת מסוג 2. לפיכך, מטרת שיטה זו היא לספק מודל ex vivo רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לבחינת ריפוי פצעים אצל אנשים בסיכון לפצעים כרוניים, המאפשר ניתוח טרנסקריפטומי כדי לקדם את הזיהוי של מטרות טיפוליות חדשות.

ישנם מספר מודלים זמינים כיום לחקר ריפוי פצעים, ולכל אחד מהם יש את החוזקות והחולשות שלו. מודלים של בעלי חיים in vivo, כגון עכבר db/db² או חולדות סוכרתיות המושרות על ידי סטרפטוזוטוצין³ נמצאים בשימוש נרחב; עם זאת, פצעים במודלים של מכרסמים נרפאים באמצעות התכווצות, השונה מאוד מהמנגנון המופעל בגוף האדם, ויש להם הצלחה מוגבלת בתרגום לניסויים קליניים ^4,5. היתרונות של שימוש ברקמה אנושית מוכרים היטב⁴, אך הם מסובכים על ידי האתיקה של גרימת פצעים ניסיוניים לאנשים שכבר ידועים כסובלים מתגובת ריפוי פצעים לקויה. כתוצאה מכך, מחקרים על נבדקים אנושיים עם סוכרת מכוונים בדרך כלל לתגובה הדלקתית ולא לניסויים ברקמה שנכרתה⁶. ניתן להשיג גם דגמי איבר על שבב⁷ ועור מלאכותי⁸. לאלה יש יתרון בכך שהם יכולים לנתח תרומות של תאים אנושיים אך נותנים אינדיקציה מועטה לשונות בין מטופלים. לפיכך, מודלים רלוונטיים מבחינה קלינית לחקר התקדמות ריפוי הפצעים באוכלוסיות חולים פגיעות יכולים להאיץ את ההבנה המכאניסטית וגילוי התרופות בתחום זה.

פרוטוקול הפציעה ex vivo המתואר להלן מותאם מ- Stojadinovic and Tomic-Canic, 2013⁹. הוא מתאים לבחינת נתוני שעתוק מפציעה מבוקרת של דגימות רקמה אנושית ex vivo וניתן ליישם אותו על דגימות קליניות של חולים עם ריפוי פצעים לקוי (למשל, סוכרת מסוג 2, קשישים), על מנת לקדם את הידע על האופן שבו ריפוי פצעים מושפע במצבים אלה וכיצד ניתן לשחזר אותו.

Protocol

פרוטוקול זה מסתמך על אספקת רקמה כירורגית אנושית. אישור אתי והסכמה מדעת של המטופל הושגו לפני הניסוי, והמחקר תאם את העקרונות המתוארים בהצהרת הלסינקי.

1. איסוף רקמות ופציעה ex vivo

1. אסוף רקמה כירורגית לאחר קטיעה/ניתוח גפיים למיכל סטרילי המכיל את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם 5% פניצילין-סטרפטומיצין-פטרייזון, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS; מדיום גידול מלא).
   הערה: ניתן לאחסן רקמות שנאספו באופן זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני הניסוי. כדי להבטיח את כדאיות הרקמה לניסויים ex vivo , מומלץ לעבד את הרקמה בהקדם האפשרי או לשמור על מרווח זמן קבוע בין איסוף לפציעה כדי לתקנן ניסויים על פני תרומות רקמות מרובות. אם יש לאחסן את הרקמה למשך זמן כלשהו, יש להוסיף לדגימה תמיסת ייצוב RNA כדי לשמור על שלמות ה-RNA.
2. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ מלאה בתמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) בתוספת 5% פניצילין-סטרפטומיצין-פטרייה. חתוך את השומן מהדרמיס באמצעות אזמל סטרילי ו/או מספריים כירורגיים והשליך. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי טרייה במילוי PBS סטרילי.
3. חבר שני להבים סטריליים יחד כך שיהיה רווח של 1 מ"מ בין שני הלהבים. ציון שני קווים ליניאריים מקבילים, ~1 מ"מ זה מזה, לאורך האפידרמיס והחלק העליון של הדרמיס הפפילרי^10,11.
4. הסר את האפידרמיס בין קווי הניקוד באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים כירורגיים ליצירת פצע ליניארי.
5. השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה למלבנים קטנים (גודל מקסימלי של 1 ס"מ²) המקיפים את הפצע עם אפידרמיס שלם משני הצדדים.
   הערה: כדי לשמור על שלמות הרקמה וה-RNA שלאחר מכן, יש לבצע את שלבים 1.2-1.5 במהירות האפשרית.
6. צלם תמונה של הרקמה הפצועה באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה בהגדלה פי 4 כדי להבטיח ששדה הראייה לוכד את כל הפצע ואת רקמת האפידרמיס השלמה שמסביב.
7. בעזרת מלקחיים סטריליים, הניחו את מלבני הרקמה על תוספת תרבית רקמות בצלחת בת 6 בארות והשליכו בעדינות 2 מ"ל של מדיום גידול שלם לבאר. זה יבטיח שהדגימה מתורבתת בממשק נוזל-אוויר.
8. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%_CO2 באוויר למשך עד 120 שעות.
   הערה: יש לדמות את הרקמה במיקרוסקופ מיקרודיסקציה באותה הגדלה כמו בשלב 1.6 בסוף הדגירה. ניתן גם לצלם תמונות כל 24 שעות במידת הצורך.

2. קיבוע רקמות והקפאה

1. הצמד להקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. הנח כמות קטנה של מדיום חיתוך תואם קריוסטט על צ'אק קריוסטט והטמיע את הרקמה בתוכו. כוון את הרקמה בניצב לצ'אק כך שהפנים החותכות יחתכו את כל שכבות העור כולל האזור הפצוע. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. נקו את הקריוסטט בטמפרטורת החדר עם 70% אתנול ותרסיס טיהור RNase. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל-28 מעלות צלזיוס.
3. בדוק שהכיוון של הצ'אק ולהב הקריוסטט יכול לייצר קטעים המקיפים את מלוא עובי הרקמה כולל הרקמה הפצועה והדרמיס שמתחתיה.
4. בעזרת הקריוסטט, חותכים עד עשרה מקטעים של 7 מיקרומטר מכל פצע ומניחים על שקופיות מיקרו-דיסקציה נטולות RNA.
5. אחסן את השקופיות בקופסה המקורית שבה סופקו שקופיות המיקרו-דיסקציה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי להבטיח סביבה נטולת RNase.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך שים לב שפירוק ה-RNA יגדל ככל שזמן האחסון ארוך יותר.

3. לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה

1. הנח את שקופיות המיקרו-דיסקציה עם קטע הרקמה בקרח יבש ועבור לחדר מיקרוסקופ לכידת לייזר.
2. יבש באוויר^{את השקופית} הראשונה והמשך במהירות להכתים את החלקים בהמטוקסילין באמצעות ערכת צביעה המטוקסילין ואאוזין ללא RNase מיד לפני ביצוע מיקרודיסקציה של לכידת לייזר.
3. דמיין את הרקמה הפצועה באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה ללכידת לייזר בהגדלה של פי 10 וצלם תמונה של אזור העניין שיצולם בלייזר.
4. עקוב אחר אזור זה (לדוגמה, לשון אפיתל, רקמת גרנולציה, מיקרו-כלים) ואסוף למיקרודיסקציה מכסי בידוד מפזר של 0.5 מ"ל באמצעות הוראות התוכנה למיקרוסקופ המסוים שבו נעשה שימוש.
5. דמיין מחדש ודמיין את אזור העניין שצולם בלייזר באמצעות מיקרוסקופ מיקרודיסקציה לכידת לייזר בהגדלה של פי 10 כדי להדגים את המיקום והכריתה המלאה של הרקמה המנותחת.
   הערה: בצע לכידת לייזר עבור כל דגימה (עד 10 חלקים) למשך זמן מקסימלי של שעה אחת כדי למזער את פירוק ה-RNA.
6. הוסף מאגר אחסון RNA לצינור המכיל את הרקמה המיקרו-מנותחת בהתאם להוראות היצרן, ואחסן בקרח יבש עד שניתן יהיה להעבירו למקפיא -80 ^{מעלות צלזיוס}.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול באופן זמני כאן.

4. כימות ביטוי גנים דיפרנציאלי

1. צנטריפוגה את צינורות הדגימה במהירות מלאה למשך דקה.
2. בודד RNA מהרקמה המיקרו-מנותחת בהתאם להוראות היצרן.
3. יש לנטרל את ה-RNA בנפח סופי של 12 מיקרוליטר של מים נטולי RNase ולהגביר את ה-RNA באמצעות ערכת הגברת RNA ומחזור תרמי, בהתאם להוראות היצרן. מומלץ לבצע שני סבבי הגברה כדי להבטיח מספיק RNA להמשך ניתוח. השתמש בתנאי ההגברה בטבלה 1.

סיבוב הגברה ראשון			סיבוב הגברה שני
סינתזת גדיל ראשון			סינתזת גדיל ראשון
צעד	טמפרטורה	זמן	צעד	טמפרטורה	זמן
1	65 מעלות צלזיוס	5 דק'	1	65 מעלות צלזיוס	5 דק'
2	4 מעלות צלזיוס	אחז	2	4 מעלות צלזיוס	אחז
3	42 מעלות צלזיוס	45 דק'	3	25 מעלות צלזיוס	10 דק'
4	4 מעלות צלזיוס	אחז	4	37 מעלות צלזיוס	45 דק'
5	37 מעלות צלזיוס	20 דק'	5	4 מעלות צלזיוס	אחז
6	95 מעלות צלזיוס	5 דק'
7	4 מעלות צלזיוס	אחז	סינתזת גדיל שני
			צעד	טמפרטורה	זמן
סינתזת גדיל שני			1	95 מעלות צלזיוס	2 דק'
צעד	טמפרטורה	זמן	2	4 מעלות צלזיוס	אחז
1	95 מעלות צלזיוס	2 דק'	3	37 מעלות צלזיוס	15
2	4 מעלות צלזיוס	אחז	4	70 מעלות צלזיוס	5 דק'
3	25 מעלות צלזיוס	5 דק'	5	4 מעלות צלזיוס	אחז
4	37 מעלות צלזיוס	10 דק'
5	70 מעלות צלזיוס	5 דק'	שעתוק במבחנה
6	4 מעלות צלזיוס	אחז	צעד	טמפרטורה	זמן
			1	42 מעלות צלזיוס	6 שעות
שעתוק במבחנה			2	4 מעלות צלזיוס	אחז
צעד	טמפרטורה	זמן	3	37 מעלות צלזיוס	15 דק'
1	42 מעלות צלזיוס	3 שעות	4	4 מעלות צלזיוס	אחז
2	4 מעלות צלזיוס	אחז
3	37 מעלות צלזיוס	15 דק'
4	4 מעלות צלזיוס	אחז

טבלה 1: תנאי הגברה.

4. כמת את הריכוז והטוהר של ה-RNA המוגבר. יחסי ספיגה של A260/230 (טוהר) ו-A260/280 (מזהמים) >-1.8 מתאימים לניתוח נוסף.
   הערה: ניתן להשתמש ב-RNA מוגבר מטוהר למחקרי ביטוי גנים ממוקדים (שלבים 4.5-4.6) או לשלוח אותו לניתוח מיקרו-מערך.
5. סנתז cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך cDNA בעלת קיבולת גבוהה בהתאם להוראות היצרן. התנאים הייצוגיים הם כדלקמן:
   • 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
   • 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים
   • 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
   • החזקה של 4 מעלות צלזיוס
6. בצע PCR כמותי באמצעות 0.5 מיקרוליטר cDNA ופריימרים של 1 מיקרומטר (של הגן המבוקש) בהתאם להוראות היצרן. תנאים מייצגים ורצפי פריימר הם כדלקמן.
   1. השתמש בתנאים הבאים לתנאי PCR כמותיים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים של 95°C למשך 15 שניות ו-62°C למשך דקה אחת; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; ואחיזה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש ברצפי הפריימר הבאים:
      GAPDH
      פורוורד 5'-TATAAATTGAGCCCCGCC-3'
      הפוך 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      קדימה 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      הפוך 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. פרשנות נתונים

1. חשב את קצב ריפוי הפצע באמצעות התמונות של רקמת ex vivo שנוצרה בשלבים 1.6-1.8 באמצעות ImageJ. ישנם מספר פרסומים אחרונים המדגישים וריאציות שונות כיצד לנתח באופן אוטומטי אזורי פצע ב-ImageJ 12,13,14.
2. לכמת את ביטוי הגנים באמצעות שיטת ΔC_T , תוך השוואת מחזורי הסף של הגן המעניין בהשוואה לזה של עוזרת הבית (למשל, גליצרלדהיד-3-פוספט; GAPDH). לשם כך, שימו לב לערך ה-C_T עבור עוזרת הבית ועבור הגן המעניין.
   1. חשב את ההבדל בין שני ערכי ה-C_T כדי לנרמל את כמות ה-mRNA הקיימת ולשלוט בהבדלים בריכוזי מיצוי RNA בין בידודים שונים:
      ΔC_T = C_T (גן מעניין) - C_T (עוזרת בית)
   2. חשב את גודל ההבדל בין ערכי C_T כדי לתת את הכימות היחסי של הגן המעניין, מבוטא כאחוז של עוזרת הבית:
      כימות יחסי = (^2-ΔCT) x 100
   3. לבחון את ההבדלים בין תורמים/מצבי מחלה שונים של חולים על ידי השוואת הכימות היחסי של הגנים המעניינים עבור כל דגימה.
      הערה: ניתן למצוא סכימה של הטכניקה כולה באיור 1.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, נבחרה נקודת זמן של 48 שעות כדי להפיק תוצאות מייצגות. ניתן לראות את יצירת הפצע הראשוני ברקמה עודפת מניתוחים קוסמטיים אלקטיביים באיור 2A שבו הפצע שנכרת נראה בבירור. צביעת המטוקסילין ואאוזין מאשרת שזה יצר פצע בעובי מלא (איור 2B

Discussion

ככל שהשכיחות של הפרעות כרוניות כמו סוכרת מסוג 2 עולה ברחבי העולם, הצורך בטכניקות שיכולות להקל על מחקרים רלוונטיים מבחינה פתופיזיולוגית הופך דחוף יותר. הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה סטנדרטית לבחינת נתונים טרנסקריפטומיים מפצעי ריפוי ex vivo המשתמשים ברקמה אנושית.

<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix