Microdissecção por captura a laser em tecidos cirúrgicos para identificar a expressão gênica aberrante na cicatrização prejudicada de feridas no diabetes tipo 2

Resumo

Esta técnica fornece um guia para infligir feridas ex vivo , realizar microdissecção por captura a laser e quantificar mudanças na expressão gênica relacionadas a processos de cicatrização de feridas deficientes em diabetes usando tecido humano clinicamente relevante.

Resumo

A prevalência global do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) está aumentando rapidamente. Pacientes com DM2 sofrem de uma infinidade de complicações e uma delas é a cicatrização prejudicada de feridas. Isso pode levar ao desenvolvimento de feridas ou úlceras nos pés que não cicatrizam e, finalmente, à amputação. Em indivíduos saudáveis, a cicatrização de feridas segue uma sequência controlada e sobreposta de eventos que abrangem inflamação, proliferação e remodelação. No DM2, uma ou mais dessas etapas tornam-se disfuncionais. Os modelos atuais para estudar a cicatrização prejudicada de feridas no DM2 incluem ensaios in vitro de feridas com arranhões, equivalentes de pele ou modelos animais para examinar os mecanismos moleculares subjacentes à cicatrização de feridas e/ou possíveis opções terapêuticas. No entanto, eles não recapitulam totalmente o complexo processo de cicatrização de feridas em pacientes com DM2, e os testes cutâneos humanos ex vivo são problemáticos devido à ética de fazer biópsias por punção de pacientes onde se sabe que eles cicatrizarão mal. Aqui, é descrita uma técnica pela qual os perfis de expressão das células específicas envolvidas na resposta de cicatrização de feridas (dis)funcionais em pacientes com DM2 podem ser examinados usando tecido excedente descartado após amputação ou cirurgia estética eletiva. Neste protocolo, amostras de pele doada são coletadas, feridas, cultivadas ex vivo na interface ar-líquido, fixadas em diferentes momentos e seccionadas. Tipos de células específicas envolvidas na cicatrização de feridas (por exemplo, queratinócitos epidérmicos, fibroblastos dérmicos (papilares e reticulares), vasculatura) são isolados usando microdissecção por captura a laser e diferenças na expressão gênica analisadas por sequenciamento ou microarray, com genes de interesse validados por qPCR. Este protocolo pode ser usado para identificar diferenças inerentes na expressão gênica entre pele mal cicatrizada e intacta, em pacientes com ou sem diabetes, usando tecido normalmente descartado após a cirurgia. Isso proporcionará uma maior compreensão dos mecanismos moleculares que contribuem para as feridas crônicas do DM2 e a perda de membros inferiores.

Introdução

A incidência de diabetes tipo 2 está crescendo globalmente, impulsionada por uma epidemia de obesidade e inatividade física. A má cicatrização de feridas é comum nesses pacientes e até 25% dos pacientes desenvolverão uma ferida crônica que não cicatriza¹. Os mecanismos subjacentes a isso são complexos e incompletamente compreendidos, limitando a taxa de descoberta de novas terapêuticas. Um dos fatores que contribuem para isso é a falta de um modelo adequado para estudar a cicatrização de feridas em pacientes com diabetes tipo 2. Assim, o objetivo deste método é fornecer um modelo ex vivo fisiologicamente relevante para examinar a cicatrização de feridas em pessoas com risco de feridas crônicas, permitindo que a análise transcriptômica progrida na identificação de novos alvos terapêuticos.

Existem vários modelos atualmente disponíveis para estudar a cicatrização de feridas, e cada um tem seus pontos fortes e fracos. Modelos animais in vivo, como o camundongo db/db² ou ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina³ são amplamente utilizados; no entanto, feridas em modelos de roedores cicatrizam por contração, que é muito diferente do mecanismo empregado no corpo humano, e têm sucesso limitado na tradução para ensaios clínicos ^4,5. Os benefícios do uso de tecido humano são bem reconhecidos⁴, mas são complicados pela ética de infligir feridas experimentais em indivíduos que já são conhecidos por sustentar uma resposta de cicatrização prejudicada. Consequentemente, os estudos em seres humanos com diabetes são mais comumente direcionados para a resposta inflamatória do que para experimentos em tecido^{excisado 6}. Organ-on-a-chip⁷ e modelos de pele artificial⁸ também estão disponíveis. Eles têm o benefício de serem capazes de analisar as contribuições de células humanas, mas dão pouca indicação de variabilidade entre pacientes. Assim, modelos clinicamente relevantes para estudar o progresso da cicatrização de feridas em populações vulneráveis de pacientes podem acelerar a compreensão mecanicista e a descoberta de medicamentos nessa área.

O protocolo de ferimento ex vivo descrito abaixo é adaptado de Stojadinovic e Tomic-Canic, 2013⁹. É adequado para examinar dados transcricionais de feridas controladas de amostras de tecido humano ex vivo e pode ser aplicado a amostras clínicas de pacientes com má cicatrização de feridas (por exemplo, diabetes tipo 2, idosos), a fim de avançar o conhecimento sobre como a cicatrização de feridas é afetada nessas condições e potencialmente como ela pode ser restaurada.

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Protocolo

Este protocolo depende do fornecimento de tecido cirúrgico humano. A aprovação ética e o consentimento informado do paciente foram obtidos antes da experimentação, e o estudo estava em conformidade com os princípios descritos na Declaração de Helsinque.

1. Coleta de tecido e ferimento ex vivo

1. Colete tecido cirúrgico após amputação/cirurgia do membro em um recipiente estéril contendo o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 5% de penicilina-estreptomicina-fungizona, 2 mM de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal (FBS; meio de crescimento completo).
   NOTA: O tecido colhido desta forma pode ser armazenado a 4 °C até 24 h antes da experimentação. Para garantir a viabilidade do tecido para experimentos ex vivo , recomenda-se processar o tecido o mais rápido possível ou manter um intervalo de tempo fixo entre a coleta e a ferida para padronizar os experimentos em várias doações de tecido. Se o tecido for armazenado por qualquer período de tempo, uma solução de estabilização de RNA deve ser adicionada à amostra para manter a integridade do RNA.
2. Usando uma pinça estéril, transfira o tecido para uma placa de Petri de 60 mm preenchida com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina-fungizona a 5%. Apare a gordura da derme usando um bisturi estéril e / ou tesoura cirúrgica e descarte. Transfira o tecido para uma placa de Petri fresca cheia de PBS estéril.
3. Encaixe duas lâminas estéreis juntas de forma que haja um espaço de 1 mm entre as duas lâminas. Marcar duas linhas lineares paralelas, separadas por ~1 mm, ao longo do comprimento da epiderme e da parte superior da derme papilar^10,11.
4. Remova a epiderme entre as linhas de pontuação usando uma pinça estéril e uma tesoura cirúrgica para criar uma ferida linear.
5. Use um bisturi para cortar o tecido em pequenos retângulos (tamanho máximo de 1 cm²) abrangendo a ferida com epiderme intacta em ambos os lados.
   NOTA: Para manter a integridade do tecido e do RNA subsequente, as etapas 1.2-1.5 devem ser realizadas o mais rápido possível.
6. Tire uma imagem do tecido ferido usando um microscópio de microdissecção com ampliação de 4x, garantindo que o campo de visão capture a totalidade da ferida e o tecido epidérmico intacto circundante.
7. Usando uma pinça estéril, coloque os retângulos de tecido em uma inserção de cultura de tecidos em uma placa de 6 poços e pipete suavemente 2 mL de meio de crescimento completo no poço. Isso garantirá que a amostra seja cultivada na interface líquido-ar.
8. Incubar a 37 °C em 5% de CO₂ no ar por até 120 h.
   NOTA: O tecido deve ser visualizado em um microscópio de microdissecção com a mesma ampliação da etapa 1.6 no final da incubação. As imagens também podem ser tiradas a cada 24 horas, se necessário.

2. Fixação e crioseccionamento de tecidos

1. Congele o tecido em nitrogênio líquido. Coloque uma pequena quantidade de meio de corte compatível com criostato em um mandril de criostato e incorpore o tecido dentro dele. Oriente o tecido perpendicularmente ao mandril de modo que a face cortante corte todas as camadas da pele, incluindo a área ferida. Conservar a -80 °C.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Limpe o criostato em temperatura ambiente com etanol 70% e spray de descontaminação RNase. Defina a temperatura do criostato para -28 °C.
3. Verifique se a orientação do mandril e da lâmina do criostato pode produzir seções que abrangem toda a espessura do tecido, incluindo o tecido ferido e a derme subjacente.
4. Usando o criostato, corte até dez seções de 7 μm de cada ferida e coloque em lâminas de microdissecção sem RNA.
5. Armazene as lâminas na caixa original em que as lâminas de microdissecação foram fornecidas a -80 °C para garantir um ambiente livre de RNase.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, mas esteja ciente de que a degradação do RNA aumentará quanto maior for o tempo de armazenamento.

3. Microdissecção por captura a laser

1. Coloque as lâminas de microdissecção com a seção de tecido em gelo seco e vá para a sala do microscópio de microdissecção de captura a laser.
2. Seque ao ar a^1ª lâmina e proceda rapidamente à coloração das seções com hematoxilina usando um kit de coloração de hematoxilina e eosina sem RNase imediatamente antes de realizar a microdissecção de captura a laser.
3. Visualize o tecido ferido usando um microscópio de microdissecção de captura a laser com ampliação de 10x e tire uma foto da área de interesse que será capturada a laser.
4. Trace ao redor dessa área (por exemplo, língua epitelial, tecido de granulação, microvasos) e colete em microdissecção tampas de isolamento do difusor de 0,5 mL usando as instruções do software para o microscópio específico que está sendo usado.
5. Revisualize e visualize a área de interesse capturada a laser usando o microscópio de microdissecção de captura a laser com ampliação de 10x para demonstrar a localização e a excisão completa do tecido dissecado.
   NOTA: Realize a captura a laser para cada amostra (até 10 seções) por um tempo máximo de 1 h para minimizar a degradação do RNA.
6. Adicione o tampão de armazenamento de RNA ao tubo que contém o tecido microdissecado de acordo com as instruções do fabricante e armazene em gelo seco até que possa ser transferido para um freezer a -80 ^° C.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado temporariamente aqui.

4. Quantificação da expressão gênica diferencial

1. Centrifugue os tubos de amostra em velocidade máxima por 1 min.
2. Isole o RNA do tecido microdissecado seguindo as instruções do fabricante.
3. Eluir o RNA em um volume final de 12 μL de água livre de RNase e amplificar o RNA usando um kit de amplificação de RNA e termociclador, de acordo com as instruções do fabricante. Duas rodadas de amplificação são recomendadas para garantir RNA suficiente para análise posterior. Use as condições de amplificação na Tabela 1.

Primeira rodada de amplificação			Segunda rodada de amplicação
Síntese da primeira fita			Síntese da primeira fita
Passo	Temperatura	Hora	Passo	Temperatura	Hora
1	65 °C	5 min	1	65 °C	5 min
2	4 °C	segurar	2	4 °C	segurar
3	42 °C	45 minutos	3	25 °C	10 minutos
4	4 °C	segurar	4	37 °C	45 minutos
5	37 °C	20 minutos	5	4 °C	segurar
6	95 °C	5 min
7	4 °C	segurar	Síntese da segunda fita
			Passo	Temperatura	Hora
Síntese da segunda fita			1	95 °C	2 min
Passo	Temperatura	Hora	2	4 °C	segurar
1	95 °C	2 min	3	37 °C	15
2	4 °C	segurar	4	70 °C	5 min
3	25 °C	5 min	5	4 °C	segurar
4	37 °C	10 minutos
5	70 °C	5 min	Transcrição in vitro
6	4 °C	segurar	Passo	Temperatura	Hora
			1	42 °C	6 h
Transcrição in vitro			2	4 °C	segurar
Passo	Temperatura	Hora	3	37 °C	15 min
1	42 °C	3 h	4	4 °C	segurar
2	4 °C	segurar
3	37 °C	15 min
4	4 °C	segurar

Tabela 1: Condições de amplificação.

4. Quantificar a concentração e a pureza do RNA amplificado. As taxas de absorbância de A260/230 (pureza) e A260/280 (contaminantes) > 1,8 são adequadas para análise posterior.
   NOTA: O RNA amplificado purificado pode ser usado para estudos de expressão gênica focados (etapas 4.5-4.6) ou pode ser enviado para análise de microarray.
5. Sintetize o cDNA usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade de acordo com as instruções do fabricante. As condições representativas são as seguintes:
   • 25 °C por 10 min
   • 37 °C durante 2 h
   • 85 °C por 5 min
   • Retenção de 4 °C
6. Realize PCR quantitativo usando 0,5 μL de cDNA e primers de 1 μM (do gene de interesse) de acordo com as instruções do fabricante. As condições representativas e as sequências de primers são as seguintes.
   1. Utilizar as seguintes condições para as condições de PCR quantitativas: 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95°C por 15 s e 62°C por 1 min; 95 °C por 5 min; e 4°C de retenção.
   2. Use as seguintes sequências de primer:
      GAPDH
      Frente 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Reverso 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Frente 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Reverso 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interpretação dos dados

1. Calcule a taxa de cicatrização de feridas usando as imagens do tecido ex vivo geradas nas etapas 1.6-1.8 usando ImageJ. Existem várias publicações recentes destacando diferentes variações sobre como analisar automaticamente as áreas da ferida no ImageJ 12,13,14.
2. Quantifique a expressão gênica usando o método ΔC_T , comparando os ciclos de limiar para o gene de interesse em comparação com o da governanta (por exemplo, gliceraldeído-3-fosfato; GAPDH). Para fazer isso, observe_{o valor CT} para a governanta e para o gene de interesse.
   1. Calcule a diferença entre os_{dois valores de} CT para normalizar a quantidade de mRNA presente e controlar as diferenças nas concentrações de extração de RNA entre diferentes isolamentos:
      ΔC_T = C_T (gene de interesse) - C_T (governanta)
   2. Calcule a magnitude da diferença entre_{os valores de} CT para obter a quantificação relativa do gene de interesse, expressa em porcentagem da governanta:
      Quantificação relativa = (^2-ΔCT) x 100
   3. Examine as diferenças entre diferentes doadores de pacientes / estados de doença comparando as quantificações relativas dos genes de interesse para cada amostra.
      NOTA: Um esquema de toda a técnica pode ser encontrado na Figura 1.

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Resultados

Seguindo o protocolo, um ponto de tempo de 48 h foi escolhido para gerar resultados representativos. A criação da ferida inicial em tecido excedente de cirurgia estética eletiva pode ser vista na Figura 2A , onde a ferida excisada é claramente visível. A coloração com hematoxilina e eosina confirma que isso gerou uma ferida de espessura total (Figura 2B). Após 48 h, o fechamento parcial da ferida é visível ao microscó...

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Discussão

À medida que a incidência de doenças crônicas, como o diabetes tipo 2, aumenta globalmente, a necessidade de técnicas que possam facilitar estudos fisiopatologicamente relevantes torna-se mais urgente. O protocolo descrito acima fornece um método padronizado para examinar dados transcriptômicos de feridas em cicatrização ex vivo utilizando tecido humano.

Este protocolo depende do fornecimento de tecido clínico excedente para o qual foi conce...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix