제2형 당뇨병의 손상된 상처 치유에서 비정상적인 유전자 발현을 식별하기 위해 수술 조직에 대한 레이저 캡처 미세해부

요약

이 기술은 임상적으로 관련된 인간 조직을 사용하여 당 뇨병의 열악한 상처 치유 과정과 관련된 유전자 발현의 변화를 정량화하고, 레이저 캡처 현미해부를 수행하고, 생체 외 상처를 입히는 방법에 대한 가이드를 제공합니다.

초록

전 세계적으로 유병률인 제2형 당뇨병(T2DM)은 빠른 속도로 증가하고 있습니다. T2DM 환자는 다양한 합병증을 앓고 있으며 그 중 하나는 상처 치유 장애입니다. 이로 인해 치유되지 않는 궤양이나 족부 궤양이 발생하고 궁극적으로 절단이 될 수 있습니다. 건강한 개인의 경우, 상처 치유는 염증, 증식 및 리모델링을 포함하는 통제되고 중복되는 일련의 사건을 따릅니다. T2DM에서는 이러한 단계 중 하나 이상이 제대로 작동하지 않습니다. T2DM에서 손상된 상처 치유를 연구하기 위한 현재 모델에는 상처 치유 및/또는 잠재적인 치료 옵션을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 체외 스크래치 상처 분석, 피부 등가물 또는 동물 모델이 포함됩니다. 그러나 이것들은 T2DM 환자의 복잡한 상처 치유 과정을 완전히 요약하지 못하며, 생체 외 인간 피부 검사는 치유가 잘 되지 않는 것으로 알려진 환자로부터 펀치 생검을 받는 윤리로 인해 문제가 있습니다. 여기서, T2DM 환자에서 (dys)functional wound healing response에 관여하는 특정 세포의 발현 프로파일을 절단 또는 선택적 성형 수술 후 버려진 잉여 조직을 사용하여 검사할 수 있는 기술이 설명됩니다. 이 프로토콜에서는 기증된 피부의 샘플을 채취하고, 상처를 입히고, 공기 액체 계면에서 생체 외 배양하고, 다른 시점에 고정하고 절편화합니다. 상처 치유에 관여하는 특정 세포 유형(예: 표피 각질세포, 피부 섬유아세포(유두 및 망상), 혈관 구조)은 레이저 캡처 미세해부 및 염기서열분석 또는 마이크로어레이로 분석된 유전자 발현의 차이를 사용하여 분리하며, 관심 유전자는 qPCR로 추가로 검증합니다. 이 프로토콜은 당뇨병 유무에 관계없이 수술 후 일반적으로 버려지는 조직을 사용하여 치유가 잘 되지 않는 피부와 손상되지 않은 피부 사이의 유전자 발현에 내재된 차이를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 통해 T2DM 만성 상처와 하지 손실에 기여하는 분자 메커니즘에 대한 더 큰 이해를 얻을 수 있습니다.

서문

제2형 당뇨병의 발병률은 비만 유행병과 신체 활동 부족으로 인해 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 이러한 환자에서는 상처 치유가 잘 되지 않는 경우가 흔하며, 최대 25%의 환자가 치유되지 않는 만성 상처로 발전한다¹. 이를 뒷받침하는 메커니즘은 복잡하고 불완전하게 이해되어 새로운 치료법의 발견 속도를 제한합니다. 이에 기여하는 요인 중 하나는 제2형 당뇨병 환자의 상처 치유를 연구하기 위한 적절한 모델이 없다는 것입니다. 따라서 이 방법의 목적은 만성 상처의 위험이 있는 사람들의 상처 치유를 검사하기 위해 생리학적으로 관련된 생체 외 모델을 제공하여 전사체 분석을 통해 새로운 치료 표적의 식별을 진행할 수 있도록 하는 것입니다.

현재 상처 치유를 연구하는 데 사용할 수 있는 여러 모델이 있으며 각각 강점과 약점이 있습니다. db/db mouse² 또는 streptozotocin-induced diabetic rats³와 같은 생체 내 동물 모델이 널리 사용됩니다. 그러나 설치류 모델의 상처는 수축을 통해 치유되는데, 이는 인체에서 사용되는 메커니즘과 매우 다르며 임상 시험으로의 전환에는 제한적인 성공을 거두었습니다 ^4,5. 인체 조직 사용의 이점은 잘 알려져 있지만⁴ 이미 손상된 상처 치유 반응을 유지하는 것으로 알려진 개인에게 실험적 상처를 입히는 윤리로 인해 복잡합니다. 결과적으로, 당뇨병이 있는 인간을 대상으로 한 연구는 절제된 조직을 대상으로 실험하기보다는 염증 반응에 초점을 맞추는 경우가 더 일반적이다⁶. 장기 칩⁷ 및 인공 피부 모델⁸도 사용할 수 있습니다. 이는 인간 세포의 기여도를 분석할 수 있다는 이점이 있지만 환자 간 변동성에 대한 지표는 거의 제공하지 않습니다. 따라서 취약한 환자 집단에서 상처 치유의 진행 상황을 연구하기 위한 임상적으로 관련된 모델은 이 분야에서 기계론적 이해와 약물 발견을 가속화할 수 있습니다.

아래에 기술된 생체 외 상처 프로토콜은 Stojadinovic and Tomic-Canic, 2013⁹에서 발췌한 것이다. 생체 외 인체 조직 샘플의 통제된 상처로부터 전사 데이터를 검사하는 데 적합하며, 상처 치유가 잘 되지 않는 환자(예: 제2형 당뇨병, 노인)의 임상 샘플에 적용하여 이러한 조건에서 상처 치유가 어떻게 영향을 미치고 잠재적으로 어떻게 회복될 수 있는지에 대한 지식을 발전시킬 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 인간 수술 조직의 제공에 의존합니다. 실험 전에 윤리적 승인과 정보에 입각한 환자의 동의를 얻었으며, 연구는 헬싱키 선언에 요약된 원칙을 준수했습니다.

1. 조직 및 체외 상처의 채취

1. 사지 절단/수술 후 수술 조직을 5% 페니실린-스트렙토마이신-곰팡이존, 2mM L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청(FBS, 완전 성장 배지)이 포함된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)이 들어 있는 멸균 용기에 수집합니다.
   참고: 이러한 방식으로 수집된 조직은 실험 전에 최대 24시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 체외 실험을 위한 조직의 생존 가능성을 보장하려면 가능한 한 빨리 조직을 처리하거나 여러 조직 기증에 걸쳐 실험을 표준화하기 위해 채취와 상처 제거 사이에 고정된 시간 간격을 유지하는 것이 좋습니다. 조직을 일정 시간 동안 보관해야 하는 경우 RNA 무결성을 유지하기 위해 RNA 안정화 용액을 샘플에 추가해야 합니다.
2. 멸균 겸자를 사용하여 5% 페니실린-스트렙토마이신-곰팡이존이 보충된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 60mm 페트리 접시에 조직을 옮깁니다. 멸균 메스 및/또는 수술용 가위를 사용하여 진피의 지방을 제거하고 폐기합니다. 멸균 PBS로 채워진 새 페트리 접시에 조직을 옮깁니다.
3. 두 개의 멸균 블레이드 사이에 1mm의 간격이 있도록 두 개의 멸균 블레이드를 함께 부착합니다. 표피의 길이와 유두 진피의 상부를 가로질러 ~1mm 떨어진 두 개의 평행한 선형 선을 점수^10,11.
4. 멸균 집게와 수술용 가위를 사용하여 점수 선 사이의 표피를 제거하여 선형 상처를 만듭니다.
5. 메스를 사용하여 조직을 작은 직사각형(최대 크기 1cm²)으로 자르고 양쪽에 표피가 손상되지 않은 상처를 둘러쌉니다.
   참고: 조직 및 후속 RNA 무결성을 유지하려면 가능한 한 빨리 1.2-1.5단계를 수행해야 합니다.
6. 4배 배율의 현미해부 현미경을 사용하여 상처 조직의 이미지를 촬영하여 시야가 상처 전체와 주변의 온전한 표피 조직을 캡처하도록 합니다.
7. 멸균 겸자를 사용하여 조직 사각형을 6웰 플레이트의 조직 배양 삽입물에 놓고 2mL의 완전한 성장 배지를 웰에 부드럽게 피펫팅합니다. 이렇게 하면 샘플이 액체-공기 계면에서 배양됩니다.
8. 37 ° C에서 최대 120 시간 동안 공기 중 5 % CO₂ 배양하십시오.
   참고: 조직은 배양 종료 시 1.6단계와 동일한 배율로 현미해부 현미경에서 이미지화해야 합니다. 필요한 경우 24시간마다 이미지를 촬영할 수도 있습니다.

2. 조직 정착과 cryosectioning

1. 조직을 액체 질소로 스냅 동결합니다. 소량의 저온 유지 장치 호환 절단 매체를 저온 유지 장치 척에 놓고 그 안에 조직을 삽입합니다. 절단면이 상처 부위를 포함한 피부의 모든 층을 절단할 수 있도록 조직을 척에 수직으로 향하게 합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
2. 70% 에탄올 및 RNase 오염 제거 스프레이로 실온에서 저온 유지 장치를 세척합니다. 저온 유지 온도를 -28 °C로 설정합니다.
3. 척과 저온 유지 장치 블레이드의 방향이 상처 조직과 그 아래 진피를 포함한 조직의 전체 두께를 포함하는 단면을 생성할 수 있는지 확인하십시오.
4. 저온 유지 장치를 사용하여 각 상처에서 최대 10개의 7μm 절편을 절단하고 RNA가 없는 현미해부 슬라이드에 놓습니다.
5. RNase가 없는 환경을 보장하기 위해 -80°C에서 현저해부 슬라이드가 제공된 원래 상자에 슬라이드를 보관하십시오.
   참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있지만 보관 시간이 길어질수록 RNA 분해가 증가한다는 점에 유의하십시오.

3. 레이저 캡처 현미해부

1. 조직 섹션이 있는 현미해부 슬라이드를 드라이아이스에 넣고 레이저 캡처 현미해부 현미경실로 이동합니다.
2. 1st^{슬라이드를} 자연 건조하고 레이저 캡처 현미해부를 수행하기 직전에 RNase-free hematoxylin 및 eosin 염색 키트를 사용하여 hematoxylin으로 섹션을 빠르게 염색합니다.
3. 레이저 캡처 현미해부 현미경을 사용하여 10배 배율로 상처 조직을 시각화하고 레이저로 캡처할 관심 영역의 사진을 촬영합니다.
4. 해당 영역(예: 상피 혀, 육아 조직, 미세혈관) 주위를 추적하고 사용 중인 특정 현미경에 대한 소프트웨어 지침을 사용하여 0.5mL 확산기 분리 캡을 현미해부에 수집합니다.
5. 레이저 캡처 현미해부 현미경을 사용하여 10배 배율로 레이저로 캡처한 관심 영역을 다시 시각화하고 이미지화하여 절개된 조직의 위치와 완전한 절제를 시연합니다.
   참고: RNA 분해를 최소화하기 위해 최대 1시간 동안 각 샘플(최대 10개 섹션)에 대해 레이저 캡처를 수행합니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 미세 절제된 조직이 들어 있는 튜브에 RNA 보관 버퍼를 추가하고 -80^°C 냉동고로 옮길 수 있을 때까지 드라이아이스에 보관합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시적으로 일시 중지할 수 있습니다.

4. 차등 유전자 발현의 정량화

1. 샘플 튜브를 1분 동안 최고 속도로 원심분리합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 미세 절개된 조직에서 RNA를 분리합니다.
3. 최종 부피의 RNase 자유수 12μL로 RNA를 용리하고 제조업체의 지침에 따라 RNA 증폭 키트와 열 순환기를 사용하여 RNA를 증폭합니다. 추가 분석을 위한 충분한 RNA를 보장하기 위해 두 차례의 증폭이 권장됩니다. 표 1의 증폭 조건을 사용합니다.

첫 번째 증폭 라운드			두 번째 증폭 라운드
첫 번째 가닥 합성			첫 번째 가닥 합성
걸음	온도	시간	걸음	온도	시간
1	65 기음	5 분	1	65 기음	5 분
2	4 기음	들다	2	4 기음	들다
3	42 기음	45 분	3	25 기음	10분
4	4 기음	들다	4	37 기음	45 분
5	37 기음	20분	5	4 기음	들다
6	95 기음	5 분
7	4 기음	들다	두 번째 가닥 합성
			걸음	온도	시간
두 번째 가닥 합성			1	95 기음	2 분
걸음	온도	시간	2	4 기음	들다
1	95 기음	2 분	3	37 기음	15
2	4 기음	들다	4	70 기음	5 분
3	25 기음	5 분	5	4 기음	들다
4	37 기음	10분
5	70 기음	5 분	체외 전사
6	4 기음	들다	걸음	온도	시간
			1	42 기음	6시간
체외 전사			2	4 기음	들다
걸음	온도	시간	3	37 기음	15 분
1	42 기음	3시간	4	4 기음	들다
2	4 기음	들다
3	37 기음	15 분
4	4 기음	들다

표 1: 증폭 조건.

4. 증폭된 RNA의 농도와 순도를 정량화합니다. A260/230(순도) 및 A260/280(오염 물질) > 1.8의 흡광도 비율은 추가 분석에 적합합니다.
   참고: 정제된 증폭 RNA는 집중된 유전자 발현 연구(단계 4.5-4.6)에 사용하거나 마이크로어레이 분석을 위해 보낼 수 있습니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다. 대표적인 조건은 다음과 같습니다.
   • 25 °C 10 분 동안
   • 37 ° C 2 시간 동안
   • 85 분 동안 5 °C
   • 4°C 유지
6. 제조업체의 지침에 따라 0.5 μL의 cDNA와 1 μM 프라이머(관심 유전자)를 사용하여 정량적 PCR을 수행합니다. 대표적인 조건 및 프라이머 서열은 다음과 같다.
   1. 정량적 PCR 조건에는 다음 조건을 사용하십시오 : 95 분 동안 10 °C; 15초 동안 95°C, 1분 동안 62°C의 40주기; 95 분 동안 5 °C; 및 4°C 유지.
   2. 다음 프라이머 시퀀스를 사용합니다.
      갭디(GAPDH)
      포워드 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      리버스 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      포워드 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      리버스 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. 데이터 해석

1. ImageJ를 사용하여 1.6-1.8단계에서 생성된 생체 외 조직의 이미지를 사용하여 상처 치유 속도를 계산합니다. ImageJ ^12,13,14에서 상처 부위를 자동으로 분석하는 방법에 대한 다양한 변형을 강조하는 여러 최근 간행물이 있습니다.
2. ΔC_T 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화하고, 관심 유전자의 역치 주기를 가정부의 역치 주기와 비교합니다(예: 글리세르알데히드-3-인산염; GAPDH)를 참조하십시오. 이렇게하려면 가사도우미와 관심있는 유전자에 대한 C_T 값을 기록하십시오.
   1. 두_{C T} 값 간의 차이를 계산하여 존재하는 mRNA의 양을 정규화하고 서로 다른 분리 간의 RNA 추출 농도 차이를 제어합니다.
      ΔC_T = C_T (관심 유전자) - C_T (가사도우미)
   2. C_T 값 간의 차이 크기를 계산하여 가정부의 백분율로 표현된 관심 유전자의 상대적 정량화를 제공합니다.
      상대 정량화 = (^2-ΔCT) x 100
   3. 각 샘플에 대한 관심 유전자의 상대적 정량화를 비교하여 서로 다른 환자 기증자/질병 상태 간의 차이점을 조사합니다.
      참고: 전체 기술의 개략도는 그림 1에서 찾을 수 있습니다.

결과

프로토콜에 따라 대표 결과를 생성하기 위해 48시간 시점이 선택되었습니다. 선택적 성형 수술로 인한 잉여 조직에서 초기 상처가 생성되는 것은 절제된 상처가 명확하게 보이는 그림 2A 에서 볼 수 있습니다. 헤마톡실린(Haematoxylin)과 에오신 염색(eosin staining)은 이로 인해 전체 두께의 상처가 생성되었음을 확인합니다(그림 2B). ...

토론

제2형 당뇨병과 같은 만성 질환의 발병률이 전 세계적으로 증가함에 따라 병태생리학적으로 관련된 연구를 촉진할 수 있는 기술의 필요성이 더욱 시급해지고 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜은 인간 조직을 활용하여 생체 외 치유 상처의 전사체 데이터를 검사하기 위한 표준화된 방법을 제공합니다.

이 프로토콜은 관련 당국으로부터 윤리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA amplification kit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissection caps; 50 pack
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	With 1000 mg/L glucose, L-glutamine, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Foetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Cell culture supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-free haematoxylin and eosin staining kit
High capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcription kit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Cell culture supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer capture microdissection slides; 5 per box
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Cell culture insert
Penicillin-Streptomycin-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Cell culture supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatible cutting medium
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Five tablets per 100ml sterile water and then autoclaved for cell culture use
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA extraction kit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Sterile blades	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Tissue dissection implements
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissection support slide, RNase-free
Surgical scissors	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Tissue dissection implements
Surgical forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Tissue dissection implements
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Quantitative PCR mastermix