使用附睾白色脂肪组织进行脂肪覆盖的胰岛移植

摘要

这种脂肪覆盖的胰岛移植方法适用于检测腹膜腔内的移植胰岛。值得注意的是，它不需要使用生物结合剂或缝合。

摘要

胰岛移植是严重糖尿病的细胞替代疗法。腹腔通常是该手术的移植部位。然而，腹腔内胰岛移植存在一定的局限性，包括移植效果差，移植物检测能力困难，移植后分析缺乏移植切除能力。本文采用"脂肪覆盖胰岛移植"，一种利用附睾白色脂肪组织的腹膜内胰岛移植方法，用于评估生物工程胰岛的治疗效果。该方法的简单之处在于将胰岛播种到附睾白色脂肪组织上，并利用组织覆盖胰岛。虽然这种方法可以归类为腹膜内胰岛移植技术，但它与脂肪内组织胰岛移植具有共同特征。然而，脂肪覆盖的胰岛移植方法显示出比脂肪内组织胰岛移植更强大的治疗效果，包括改善血糖和血浆胰岛素水平以及移植物切除的潜力。我们建议采用这种方法来评估胰岛植入白色脂肪组织的机制和生物工程胰岛的治疗效果。

引言

胰岛移植是重度糖尿病患者的细胞替代疗法。最近的报告显示，移植后三年的胰岛素独立率提高到44%¹ ，在接受超过600，000个胰岛当量的接受者中，约有80%实现了胰岛素独立²。此外，在最新的协作胰岛移植登记报告中，显示超过70%的单独胰岛移植患者的空腹血糖水平在5年内保持在60-140mg / dL。该研究还确定，在肾移植后单独接受胰岛移植或胰岛移植的患者中，约有90%在5年内没有发生任何严重的低血糖事件³。

尽管这种治疗的临床结果一直在改善，但仍必须解决一些局限性，包括建立最佳移植部位的必要性。肝脏是临床胰岛移植的典型移植部位，因为它是可容纳大量胰岛的最大器官。然而，在一些患者中，肝脏不可用（例如，由于门静脉高压、肝炎和/或肝硬化⁴），因此其他部位，包括肾囊下间隙⁵，⁶、网膜袋⁷，⁸，^9，10、肠系膜 11、胃肠道 12、骨骼肌 13、皮下组织 13、骨髓 ¹⁴ 和脾脏¹⁵，¹⁶，^17，已被考虑作为替代移植部位。

虽然腹腔内胰岛移植在局部麻醉下容易进行，使腹腔内腔成为临床胰岛移植的吸引人部位，但在移植时，胰岛分散在整个腹腔内，难以进行胰岛植入检测和成功植入确认。因此，腹腔内尚未被广泛认为是理想的临床移植部位。相反，它经常被用作临床前研究的对照模型，以研究移植封装¹⁸ 和生物工程胰岛¹⁹的有效性。然而，由于在进行准确的植入评估方面存在挑战，很难在生物工程胰岛和对照胰岛之间进行精确比较。

相比之下，在网膜袋⁸、肠系膜和其他肝外部位使用腹膜内白色脂肪组织已被充分报道10，20，²¹，22，^23，许多调查使用白色脂肪组织移植的生物工程胰岛功能的研究能够报告有希望的治疗结果²⁰，²⁴，^25，26.由于附睾脂肪组织的使用有助于移植胰岛的检测，因此开发了利用附睾脂肪组织的"脂肪覆盖胰岛移植方法"，以克服腹腔内胰岛移植的局限性。本文描述了使用附睾脂肪组织进行脂肪覆盖的胰岛移植。

研究方案

以下过程分三个步骤执行。第一步包括在受体小鼠中诱导糖尿病和分离供体胰岛。第二步涉及移植前胰岛的准备。在第三步中，将胰岛移植到附睾脂肪组织上，并使用脂肪组织覆盖胰岛。之后，评估治疗效果。本研究中对小鼠的处理和实验程序符合"实验动物护理原则"（实验动物护理和使用指南，美国国立卫生研究院出版物第^8版，2011年），实验方案获得福冈大学动物护理和使用委员会的批准（批准文号: 186018).

1. 手术准备

1. 诱导糖尿病:通过静脉注射在0.1M柠檬酸盐缓冲液（180mg / kg体重）中制备的18mg / mL链脲佐菌素溶液，在20-25g体重，8-12周龄的受体雄性小鼠中诱导糖尿病。血糖水平超过400mg / dL的小鼠被认为是糖尿病患者。在糖尿病诱导后1周内使用糖尿病小鼠，然后附睾白色脂肪组织过度萎缩以覆盖胰岛。
2. 胰岛分离:按照Gotoh的方法²⁷ 进行胰岛分离，在移植前一天进行小鼠胰岛分离。
3. 简而言之，使用胶原酶溶液消化胰腺组织。使用适当的细胞分离溶液通过密度梯度离心分离胰岛。然后将胰岛在22°C和5%CO₂ 的培养箱中过夜（据报道，在<37°C下培养可防止胰岛死亡^{28，29，30，31}）。
   注意:在安全柜中处理纯化的胰岛培养物。使用0.22μm过滤器对所有用于胰岛分离和培养的溶液进行过滤灭菌。

2.移植胰岛的准备

1. 如图 1A所示收集适当的仪器和材料。
2. 由于消化酶（如淀粉酶和脂肪酶）可能导致分离和移植胰岛的损伤，并且胰岛因被困在培养皿内的污染纤维组织中而丢失，因此在移植之前，使用镊子从胰腺中手工挑选任何额外的胰岛成分，包括腺泡和纤维组织（图1B）， 在解剖显微镜下。拾取后，使用细胞过滤器过滤掉单个腺泡细胞。
3. 将过滤后的胰岛转移到含有任何适当培养基或缓冲溶液（例如，低葡萄糖DMEM，RPMI1640，CMRL1066或HBSS）的新培养皿中，并补充有牛血清或白蛋白以防止胰岛附着在塑料上并旋转培养皿以将胰岛定位在培养皿的中心（图1C）。使用P200微量移液器和显微镜，将单个胰岛挑入适当的收集管中（图1D）。
4. 将一个新的40μm细胞过滤器放在50 mL塑料管的顶部（图1E左侧和中间），并用新鲜培养基清洗过滤器（图1E右）。
5. 使用1000 μL移液器将胰岛添加到过滤器中，以分离胰岛和单个腺泡细胞（图1 F1和图1F2）。
   注意:细胞过滤器上的纯化胰岛将大约是100%纯的。
6. 使用镊子在新的60或100毫米大小的未处理培养皿上倒置过滤器，该培养皿含有培养基或补充有牛血清或白蛋白的适当缓冲溶液（图1 F3和图1F4）。使用新鲜培养基/缓冲液将胰岛冲洗到新的培养皿中。然后将足够的培养基/缓冲液添加到培养皿中，使其总体积达到约20 mL。
7. 在显微镜下计数胰岛，并根据供体动物的数量在单个1.5 mL塑料离心管之间平均分配胰岛数量（图1G）。例如，将来自两只小鼠的两百只100-200μm胰岛当量（IEQ）添加到两只管中的每一只中。
8. 在室温下1分钟内以2，100×g离心胰岛并弃去上清液。大约 20-30 μL 的残留溶液通常会保留在管中（图 1H）。

3.胰岛移植到附睾脂肪组织上，并覆盖附睾白色脂肪组织

1. 手术前，收集小动物麻醉机、体视显微镜、光源、50-200 μL 微量移液器和 200 μL 微量移液器吸头、棉签、4-0 缝合套件和消毒手术器械（图 2A）。高压灭菌库珀剪刀，眼科剪刀，蕊子，镊子和针架。高压灭菌后，将设备浸入1%聚维酮碘溶液中（图2A）。使用棉签动员附睾白色脂肪组织，并在出血的情况下止血。使用带有 50-200 μL 吸头的微量移液器进行胰岛移植。
2. 使用吸入麻醉剂（氧气中的2%异氟醚）向糖尿病受体小鼠提供麻醉。在双眼上涂抹眼科润滑剂以防止干燥。然后将鼠标置于仰卧位（图2B左）并从腹部去除毛发以防止使用理发器和/或脱毛膏感染。使用至少三轮交替的聚维酮碘溶液，然后用70%乙醇对腹部和腹股沟区域进行消毒（图2B右）。手术前，通过没有脚趾夹反射来确认麻醉深度。使用加热垫提供术中热支持，并使用手术单固定无菌手术区域。
3. 在下中位区域切开皮肤（图2C左）。建议切开长约 2 cm 的皮肤切口。用Pean镊子夹住左腹壁（也可以使用无创伤钳或牵开器）并将组织拉到小鼠的左侧以固定手术区域（图2C右）。剖腹手术后，将异氟醚的百分比降低至1.0-1.5%以维持麻醉。
4. 使用棉签将小肠和大肠移动到小鼠的右侧（即操作员的左侧）。腹腔内的左附睾白色脂肪组织位于左腹股沟区域。将附睾白色脂肪组织和左侧睾丸移动到腹部外侧（图2D左）并伸展组织（右图2D）。
5. 使用配备 200 μL 移液器吸头的 P200 微量移液器，轻轻移液从一个 1.5 mL 管中收集整个胰岛体积（图 2E 左），注意收集时管中没有胰岛。让收集的胰岛通过重力沉降到移液器的尖端（图2E右）。
6. 将微量移液器吸头轻轻放在膨胀的脂肪组织上。注意防止尖端培养基/缓冲液过度冲洗，小心地将胰岛接种到组织上（图2F左）。接种后，确认胰岛在解剖显微镜下的正确放置（图2F右）。
7. 用附睾白色脂肪组织覆盖胰岛（图2G）。不需要使用缝合线或生物结合剂。
8. 将左睾丸放在附睾白色脂肪组织下，并将组织返回到腹膜腔（图2H）。使用4-0缝合线将皮肤封闭成两层（腹膜，然后是肌肉和皮肤）（可以使用尼龙或可吸收缝合线等缝合线）（图2I）。注射乙酰水杨酸（300毫克/千克;SQ）靠近伤口进行术后镇痛。然后将鼠标放在加热灯下并监视直到完全恢复。

4. 胰岛移植后的监测（摘要）

1. 通过监测血糖、糖耐量试验和术后组织学评估 （POD） 来评估胰岛移植的治疗效果 28.
   1. 使用小型血糖仪监测血糖，包括在葡萄糖耐量试验中测量血糖。
   2. 从尾静脉收集血液样本（一点微升）。关于组织学评估，通过免疫组织化学在移植的附睾脂肪组织中检测到小鼠胰岛素（用于检测移植胰岛）和血管性血友病因子（用于检测血管，这是胰岛植入的证据）。

结果

为了比较脂肪覆盖胰岛移植与腹膜内胰岛移植后的移植效果，将相同数量的胰岛植入对照受体糖尿病动物左侧结肠旁间隙的腹膜上。与腹膜内胰岛移植小鼠相比，观察到脂肪覆盖胰岛移植小鼠的血糖水平逐渐显着降低（p = 0.0023; 图3A）。移植后1个月，脂肪覆盖胰岛移植小鼠的血糖维持在低于腹膜内胰岛移植小鼠的血糖水平，通过腹膜内葡萄糖耐量试验评估（p = 0.0046;

讨论

脂肪覆盖的胰岛移植方法结合了两种不同移植技术的技术:腹膜内胰岛移植和脂肪内组织胰岛移植。由于附睾白色脂肪组织的表面膜被认为是被腹膜覆盖并附着在附睾上的白色脂肪组织，因此脂肪覆盖胰岛移植方法在解剖学上可归类为腹膜内胰岛移植的一种。然而，将胰岛输送给受体动物的技术更类似于脂肪内组织胰岛移植中使用的技术。我们的数据显示，脂肪覆盖胰岛移植方法的治疗效果优于腹...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor