Трансплантация островков, покрытых жиром, с использованием придатковой белой жировой ткани

Резюме

Этот метод трансплантации островков, покрытых жиром, подходит для обнаружения приживленных островков во внутрибрюшинной полости. Примечательно, что он не требует использования биосвязывающих агентов или наложения швов.

Аннотация

Трансплантация островков – это клеточная заместительная терапия тяжелого сахарного диабета. Внутрибрюшинная полость обычно является местом трансплантации для этой процедуры. Тем не менее, внутрибрюшинная трансплантация островков имеет некоторые ограничения, включая низкую эффективность трансплантации, сложную способность обнаружения трансплантата и отсутствие возможности трансплантэктомии для посттрансплантационного анализа. В этой статье для оценки терапевтических эффектов биоинженерных островков используется «трансплантация островков, покрытых жиром», метод внутрибрюшинной трансплантации островков, который использует придаток яичка белого жира. Простота метода заключается в посеве островков на придаток яичка белого жирового волокна и использовании ткани для покрытия островков. Хотя этот метод можно классифицировать как метод внутрибрюшинной трансплантации островков, он имеет общие характеристики с трансплантацией островков внутри жировой ткани. Однако метод трансплантации островков, покрытых жиром, демонстрирует более надежные терапевтические эффекты, чем трансплантация островков внутри жировой ткани, включая улучшение уровня глюкозы в крови и инсулина в плазме и потенциал для удаления трансплантата. Мы рекомендуем принять этот метод для оценки механизмов приживления островков в белую жировую ткань и терапевтических эффектов биоинженерных островков.

Введение

Трансплантация островков – это клеточная заместительная терапия для пациентов с тяжелым сахарным диабетом. Недавние отчеты показали, что показатели инсулинонезависимости через три года после трансплантации улучшаются до 44%¹ и что примерно 80% реципиентов, которые получают более 600 000 общих эквивалентов островков, достигают независимости от инсулина². Кроме того, в последнем отчете Collaborative Islet Transplant Registry было выявлено, что уровень глюкозы в крови натощак поддерживался на уровне 60-140 мг / дл в течение 5 лет у более чем 70% пациентов, перенесших трансплантацию островков в одиночку. Исследование также определило, что около 90% пациентов, которые получили трансплантацию островка в одиночку или трансплантацию островка после пересадки почки, не развивали каких-либо тяжелых гипогликемических событий в течение более 5 лет³.

Хотя клинические результаты этого лечения улучшаются, некоторые ограничения все еще должны быть устранены, включая необходимость создания оптимального места трансплантации. Печень является типичным местом трансплантации для клинической трансплантации островков, потому что это самый большой орган, который может вместить большой объем островков. Однако у некоторых пациентов печень недоступна (например, из-за портальной гипертензии, гепатита и/или цирроза^{печени 4}) и, следовательно, другие участки, включая почечное субкапсулярное пространство ^5,6, сальниковый мешочек ^7,8,9,10, брыжейки¹¹, желудочно-кишечный тракт¹², скелетные мышцы¹³, подкожную клетчатку¹³, костный мозг¹⁴ и селезенку^{15 ,16,17}, рассматривались в качестве альтернативных мест трансплантации.

Хотя внутрибрюшинная трансплантация островков может быть легко выполнена под местной анестезией, что делает внутрибрюшинную полость привлекательным местом для клинической трансплантации островков, при трансплантации островки рассеиваются по всей внутрибрюшинной полости, что затрудняет обнаружение приживления островков и успешное подтверждение приживления. Поэтому внутрибрюшинная полость не получила широкого признания в качестве идеального клинического места трансплантации. Вместо этого он часто используется в качестве контрольной модели для доклинических исследований для изучения эффективности трансплантированных инкапсулированных¹⁸ и биоинженерных островков¹⁹. Тем не менее, точное сравнение между биоинженерными и контрольными островками трудно достичь из-за проблем в выполнении точной оценки приживления.

Напротив, использование внутрибрюшинной белой жировой ткани в сальниковом мешочке⁸, брыжейке и других внепеченочных местах было хорошо зарегистрировано 10,20,21,22,23, и многие исследования, изучающие функцию биоинженерных островков, пересаженных с использованием белой жировой ткани, смогли сообщить о многообещающих терапевтических результатах 20,24,25^{, 26.} Поскольку использование придатков яичка жировой ткани облегчает обнаружение трансплантированных островков, был разработан «метод трансплантации островков, покрытых жиром», использующий жировую ткань придатка яичка, для преодоления ограничений внутрибрюшинной трансплантации островков. В данной работе описана трансплантация покрытых жиром островков с использованием жировой ткани придатка яичка.

протокол

Следующая процедура выполняется в три этапа. Первый шаг включает индукцию диабета у мышей-реципиентов и выделение донорских островков. Второй этап предполагает подготовку островков перед трансплантацией. На третьем этапе проводится трансплантация островков на жировую ткань придатка яичка и покрытие островков с использованием жировой ткани. После этого оценивали терапевтические эффекты. Обращение с мышами и экспериментальные процедуры, выполненные в этом исследовании, соответствуют «Принципам ухода за лабораторными животными» (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, публикация Национальных институтов здравоохранения,^8-е издание, 2011 г.), а экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Фукуока (номер одобрения: 186018).

1. Хирургическая подготовка

1. Индукция диабета: Индуцирование диабета в 20-25 г массы тела, 8-12-недельных самцов мышей-реципиентов путем внутривенного введения раствора стрептозотоцина 18 мг/мл, приготовленного в 0,1М цитратного буфера (180 мг/кг массы тела). Мыши с уровнем глюкозы в крови, превышающим 400 мг/дл, считаются диабетиками. Используйте мышей с диабетом в течение 1 недели после индукции диабета до чрезмерной атрофии придатка яичка белой жировой ткани для покрытия островков.
2. Изоляция островков: Выполните изоляцию островков мышей за день до трансплантации по методу²⁷ Гото для изоляции островков.
3. Короче говоря, переваривайте ткани поджелудочной железы с помощью раствора коллагеназы. Изолируйте островки путем центрифугирования с градиентом плотности с использованием соответствующего раствора для разделения клеток. Затем культивируют островки в течение ночи в инкубаторе при 22 °C и 5% CO₂ (сообщалось, что культура при <37 °C предотвращает гибель островков 28,29,30,31).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте очищенные островковые культуры в шкафу безопасности. Фильтруйте и стерилизуйте все растворы, используемые для изоляции и культивирования островков, используя фильтр 0,22 мкм.

2. Подготовка островков к трансплантации

1. Соберите соответствующие приборы и материалы, как показано на рисунке 1А.
2. Поскольку пищеварительные ферменты, такие как амилаза и липаза, могут привести к повреждению изолированных и пересаженных островков, и потеря островков может произойти из-за попадания в загрязняющие фиброзные ткани в чашке для культивирования, перед трансплантацией используйте щипцы для ручного отбора любых вне островковых компонентов из поджелудочной железы, включая ацинарные и волокнистые ткани (рисунок 1B), под рассекающим микроскопом. После сбора используйте клеточный ситечко, чтобы отфильтровать отдельные ацинарные клетки.
3. Переложите отфильтрованные островки в новую чашку для культивирования, содержащую любую подходящую питательную среду или буферный раствор (например, DMEM с низким содержанием глюкозы, RPMI1640, CMRL1066 или HBSS), дополненную бычьей сывороткой или альбумином, чтобы предотвратить прикрепление островков к пластику, и закрутите тарелку, чтобы расположить островки в центре тарелки (рисунок 1C). Используя микропипетку P200 и микроскоп, выберите отдельные островки в соответствующую коллекционную трубку (рисунок 1D).
4. Поместите новый клеточный сетчатый фильтр размером 40 мкм поверх пластиковой трубки объемом 50 мл (рисунок 1Е слева и в центре) и промыть фильтр свежей средой (рисунок 1Е справа).
5. Используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы добавить островки к ситечку для разделения островков и отдельных ацинарных клеток (рисунок 1F1 и рисунок 1F2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные островки на клеточном ситечке будут примерно на 100% чистыми.
6. Используйте щипцы для инвертирования ситечка на новой необработанной чашке размером 60 или 100 мм, содержащей культуральную среду или соответствующий буферный раствор, дополненный бычьей сывороткой или альбумином (фиг.1F3 и фиг.1F4). Используйте свежую среду/буфер, чтобы промыть островки в новую культурную посуду. Затем добавьте достаточное количество среды/буфера в чашку для культивирования, чтобы достичь общего объема около 20 мл.
7. Подсчитайте островки под микроскопом и разделите количество островков поровну между отдельными пластиковыми центрифужными трубками объемом 1,5 мл в соответствии с количеством животных-доноров (рисунок 1G). Например, двести 100-200 мкм островковых эквивалентов (IEQ) от двух мышей будут добавлены к каждой из двух трубок.
8. Центрифугируйте островки при 2 100 х г в течение 1 минуты при комнатной температуре и выбросьте супернатант. Около 20-30 мкл остаточного раствора обычно остается в пробирке (рисунок 1H).

3. Пересадка островков на жировую ткань придатка яичка и покрытие яичка белой жировой тканью

1. Перед операцией соберите анестезиологический аппарат для мелких животных, стереомикроскоп, источник света, микропипетку 50-200 мкл с наконечниками микропипетки 200 мкл, ватные палочки, набор для наложения швов 4-0 и продезинфицированные хирургические инструменты (рисунок 2A). Автоклав медных ножниц, офтальмологических ножниц, щипцов pean, пинцета и держателей игл. После автоклавирования погружают оборудование в 1% повидон-йодный раствор (рисунок 2А). Используйте ватные тампоны для мобилизации придатка яичка белой жировой ткани и для гемостаза в случаях кровотечений. Используйте микропипетку с наконечниками 50-200 мкл для трансплантации островков.
2. Доставьте анестезию диабетической мыши-реципиенту с использованием ингаляционного анестетика (2% изофлурана в кислороде). Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание. Затем поместите мышь в положение лежа на спине (рисунок 2B слева) и удалите волосы с живота, чтобы предотвратить инфекцию, используя машинки для уходу за волосами и / или крем для депиляции. Дезинфицируйте брюшную полость и паховую область, используя, по крайней мере, три чередующихся раунда раствора повидона-йода с последующим 70% этанолом (рисунок 2B справа). Перед операцией подтвердите глубину анестезии через отсутствие рефлекса защемления пальца ноги. Обеспечьте интраоперационную тепловую поддержку с помощью грелки и используйте хирургическую драпировку для закрепления стерильной хирургической области.
3. Разрезайте кожу в нижней средней области (рисунок 2C слева). Рекомендуется разрез кожи длиной около 2 см. Зажмите левую брюшную стенку щипцами pean (также могут использоваться атравматические щипцы или втягиватель) и потяните ткань к левой стороне мыши, чтобы закрепить операционное поле (рисунок 2C справа). После лапаротомии уменьшают процентное содержание изофлурана до 1,0-1,5% для поддержания анестезии.
4. Используйте ватный тампон для мобилизации тонкой и толстой кишки в правую сторону мыши (т. Е. Левую сторону оператора). Левая придатковая белая жировая ткань в брюшной полости расположена в левой паховой области. Мобилизовать придаток яичка белой жировой ткани и левого яичка наружу брюшной полости (рисунок 2D слева) и растянуть ткань (2D справа).
5. Используйте микропипетку P200, оснащенную наконечником пипетки 200 мкл, чтобы собрать весь объем островков из одной трубки объемом 1,5 мл с мягкой пипеткой (рисунок 2E слева), заботясь о том, чтобы в трубке не осталось островков после сбора. Позвольте собранным островкам остепениться на кончике пипетки под действием силы тяжести (рисунок 2E справа).
6. Поместите наконечник микропипетки слегка на растянутую жировую ткань. Заботясь о предотвращении чрезмерного промывания среды/буфера в кончике, осторожно посейте островки на ткань (рисунок 2F слева). После посева подтвердите правильное размещение островков под рассекающим микроскопом (рисунок 2F справа).
7. Накройте островки придатком яичка белой жировой тканью (рисунок 2G). Использование швов или биосвязывающих средств не требуется.
8. Поместите левое яичко под белую жировую ткань придатка яичка и верните ткани во внутрибрюшинную полость (рисунок 2Н). Закройте кожу двумя слоями (брюшина, затем мышцы и кожа) с помощью шва 4-0 (можно использовать любые швы, такие как нейлон или рассасывающиеся швы) (Рисунок 2I). Вводить ацетилсалициловую кислоту (300 мг/кг; SQ) рядом с раной для послеоперационного обезболивания. Затем поместите мышь под тепловую лампу и контролируйте до полного восстановления.

4. Мониторинг после трансплантации островков (Резюме)

1. Оценить терапевтические эффекты трансплантации островков путем мониторинга уровня глюкозы в крови, глюкозотолерантного теста и гистологической оценки в послеоперационный день (POD) 28.
   1. Контролировать уровень глюкозы в крови, включая измерения глюкозы в крови при глюкозолерантном тесте, используя небольшой глюкометр.
   2. Соберите образцы крови (немного микролитров) из хвостовой вены. Что касается гистологической оценки, то мышиный инсулин (для обнаружения приживленных островков) и фактор фон Виллебранда (для обнаружения сосудов, что является доказательством приживления островков) были обнаружены в трансплантированных островках в восстановленной жировой ткани придатка яичка методом иммуногистохимии.

Результаты

Чтобы сравнить эффективность трансплантации покрытых жиром островков с таковой после внутрибрюшинной трансплантации островков, такое же количество островков было имплантировано на брюшину в левом параколическом пространстве контрольных животных-реципиентов с диабетом. Было отмеч?...

Обсуждение

Метод трансплантации островков, покрытых жиром, включает в себя методы из двух различных методов трансплантации: внутрибрюшинная трансплантация островков и трансплантация островков внутри жировой ткани. Поскольку поверхностная мембрана придатка яичка белой жировой ткани считается ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor