Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Zusammenfassung

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Zusammenfassung

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie bei schwerem Diabetes mellitus. Die intraperitoneale Höhle ist typischerweise die Transplantationsstelle für dieses Verfahren. Die intraperitoneale Inseltransplantation hat jedoch einige Einschränkungen, darunter eine schlechte Transplantationswirksamkeit, eine schwierige Transplantaterkennung und einen Mangel an Graftektomiefähigkeit für die Analyse nach der Transplantation. In diesem Artikel wird die "fettbedeckte Inseltransplantation", eine intraperitoneale Inseltransplantationsmethode, die epididymales weißes Fettgewebe verwendet, verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln zu bewerten. Die Einfachheit der Methode liegt in der Aussaat von Inseln auf epididymales weißes Fettgewebe und die Verwendung des Gewebes zur Abdeckung der Inseln. Während diese Methode als intraperitoneale Inseltransplantationstechnik kategorisiert werden kann, teilt sie Merkmale mit der Transplantation von Injektionsinseln innerhalb des Fettgewebes. Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode zeigt jedoch robustere therapeutische Wirkungen als die Inseltransplantation im intrafetten Gewebe, einschließlich der Verbesserung des Blutzucker- und Plasmainsulinspiegels und des Potenzials zur Entfernung von Transplantaten. Wir empfehlen die Anwendung dieser Methode zur Beurteilung der Mechanismen der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe und der therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln.

Einleitung

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie für Patienten mit schwerem Diabetes mellitus. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass sich die Insulinunabhängigkeitsraten drei Jahre nach der Transplantation auf bis zu 44 %¹ verbessern und dass etwa 80 % der Empfänger, die insgesamt mehr als 600.000 Inseläquivalente erhalten, eine Insulinunabhängigkeit erreichen². Darüber hinaus wurde im jüngsten Bericht des Collaborative Islet Transplant Registry festgestellt, dass der Nüchternblutzuckerspiegel bei über einen Zeitraum von 5 Jahren bei über 70% der Patienten, die sich einer Inseltransplantation unterzogen hatten, über einen Zeitraum von 5 Jahren bei 60-140 mg / dl gehalten wurde. Die Studie ergab auch, dass etwa 90% der Patienten, die nach einer Nierentransplantation nur eine Inseltransplantation oder eine Inseltransplantation erhielten, über 5 Jahre lang keine schweren hypoglykämischen Ereignisse entwickelten³.

Obwohl sich die klinischen Ergebnisse dieser Behandlung verbessert haben, müssen noch einige Einschränkungen angegangen werden, einschließlich der Notwendigkeit, eine optimale Transplantationsstelle zu etablieren. Die Leber ist eine typische Transplantationsstelle für die klinische Inseltransplantation, da sie das größte Organ ist, das ein hohes Volumen an Inseln aufnehmen kann. Bei einigen Patienten ist jedoch die Leber nicht verfügbar (z. B. aufgrund von portaler Hypertonie, Hepatitis und/oder Zirrhose⁴) und daher andere Stellen, einschließlich des renalen subkapsulären Raums^5,6, des omentalen Beutels 7,8,9,10, des Mesenteriums 11, des Magen-Darm-Trakts 12, der Skelettmuskulatur 13, des Unterhautgewebes 13^, des Knochenmarks 14 und der Milz ¹⁵ ,^16,17, wurden als alternative Transplantationsstellen in Betracht gezogen.

Obwohl die intraperitoneale Inseltransplantation leicht unter örtlicher Betäubung durchgeführt werden kann, was die intraperitoneale Höhle zu einem attraktiven Ort für die klinische Inseltransplantation macht, sind die Inseln nach der Transplantation über die gesamte intraperitoneale Höhle verteilt, was die Inseltransplantationserkennung und die erfolgreiche Bestätigung der Anpflanzung erschwert. Daher ist die intraperitoneale Höhle nicht allgemein als ideale klinische Transplantationsstelle anerkannt. Stattdessen wird es häufig als Kontrollmodell für präklinische Studien verwendet, um die Wirksamkeit von transplantierten eingekapselten¹⁸ und biotechnologisch hergestellten Inseln^{zu untersuchen 19}. Ein genauer Vergleich zwischen biotechnologisch hergestellten und Kontrollinseln ist jedoch aufgrund der Herausforderungen bei der Durchführung einer genauen Engraftment-Bewertung schwer zu erreichen.

Im Gegensatz dazu wurde die Verwendung von intraperitonealem weißem Fettgewebe im omentalen Beutel⁸, Mesenterium und anderen extrahepatischen Stellen gut berichtet 10,20,21,22,23 und viele der Studien, die die Funktion von biotechnologisch hergestellten Inseln untersuchten, die mit weißem Fettgewebe transplantiert wurden, konnten vielversprechende therapeutische Ergebnisse berichten^{20,24,25, 26}. Da die Verwendung von Nebenhodenfettgewebe den Nachweis transplantierter Inseln erleichtert, wurde die "fettbedeckte Inseltransplantationsmethode" entwickelt, bei der epididymales Fettgewebe verwendet wird, um die Einschränkungen der intraperitonealen Inseltransplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wird die fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhodenfettgewebe beschrieben.

Protokoll

Das folgende Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt. Der erste Schritt umfasst die Induktion von Diabetes bei den Empfängermäusen und die Isolierung von Spenderinseln. Der zweite Schritt beinhaltet die Vorbereitung von Inselchen vor der Transplantation. Im dritten Schritt wird die Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und die Abdeckung der Inseln mit dem Fettgewebe durchgeführt. Danach wurden die therapeutischen Wirkungen bewertet. Der Umgang mit den Mäusen und die in dieser Studie durchgeführten experimentellen Verfahren entsprechen den ''Principles of Laboratory Animal Care'' (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Institutes of Health Publikation 8^{. Auflage}, 2011), und das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Fukuoka University genehmigt (Zulassungsnummer: 186018).

1. Chirurgische Vorbereitung

1. Induktion von Diabetes: Induzieren Sie Diabetes in 20-25 g Körpergewicht, 8-12 Wochen alten männlichen Empfängermäusen durch intravenöse Injektion von 18 mg / ml Streptozotocinlösung, die in 0,1 Mio. Citratpuffer (180 mg / kg Körpergewicht) hergestellt wurde. Mäuse mit einem Blutzuckerspiegel von mehr als 400 mg / dl gelten als Diabetiker. Verwenden Sie diabetische Mäuse innerhalb von 1 Woche nach Diabetes-Induktion vor übermäßiger Atrophie des epididymalen weißen Fettgewebes zur Abdeckung der Inseln.
2. Inselisolierung: Führen Sie einen Tag vor der Transplantation eine murine Inselisolierung nach Gotohs Methode²⁷ zur Inselisolierung durch.
3. Kurz gesagt, verdauen Sie Pankreasgewebe mit Kollagenaselösung. Isolieren Sie Inseln durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung einer geeigneten Zelltrennlösung. Dann kultivieren Sie Inselchen über Nacht in einem Inkubator bei 22 °C und 5%_CO2 (Kultur bei <37 °C wurde berichtet, um den Inseltod zu verhindern 28,29,30,31).
   HINWEIS: Behandeln Sie die gereinigten Inselkulturen in einer Sicherheitswerkbank. Filtersterilisieren Sie alle Lösungen, die für die Inselisolierung und -kultur verwendet werden, mit einem 0,22-μm-Filter.

2. Vorbereitung von Inselchen für die Transplantation

1. Sammeln Sie die geeigneten Instrumente und Materialien, wie in Abbildung 1A dargestellt.
2. Da Verdauungsenzyme wie Amylase und Lipase zu einer Verletzung der isolierten und transplantierten Inseln führen können und ein Verlust von Inseln auftreten kann, wenn sie in kontaminierendem fibrösem Gewebe innerhalb der Kulturschale eingeschlossen sind, verwenden Sie vor der Transplantation eine Pinzette, um alle Komponenten der zusätzlichen Insel aus der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und Fasergewebe, von Hand auszuwählen (Abbildung 1B). unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie nach der Ernte ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern.
3. Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die ein geeignetes Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung (z. B. DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, RPMI1640, CMRL1066 oder HBSS) enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin, um eine Anhaftung der Insel an Kunststoff zu verhindern, und die Schale schwenken, um die Inseln in der Mitte der Schale zu positionieren (Abbildung 1C). Entnehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P200-Mikropipette und dem Mikroskop in ein geeignetes Sammelröhrchen (Abbildung 1D).
4. Setzen Sie ein neues, 40-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Kunststoffröhrchen (Abbildung 1E links und Mitte) und waschen Sie den Filter mit frischem Medium (Abbildung 1E rechts).
5. Verwenden Sie eine 1000-μL-Pipette, um die Inseln in das Sieb zu geben, um die Inseln und einzelnen Azinuszellen zu trennen (Abbildung 1 F1 und Abbildung 1F2).
   HINWEIS: Die gereinigten Inseln auf dem Zellsieb sind ungefähr 100% rein.
6. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf einer neuen, 60 oder 100 mm großen, unbehandelten Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, die mit Rinderserum oder Albumin ergänzt wird (Abbildung 1 F3 und Abbildung 1F4). Verwenden Sie frisches Medium/Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen. Fügen Sie dann genügend Medium/Puffer in die Kulturschale ein, um ein Gesamtvolumen von ca. 20 ml zu erreichen.
7. Zählen Sie die Inseln unter einem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf (Abbildung 1G). Zum Beispiel würden zweihundert 100-200 μm Inseläquivalente (IEQ) von zwei Mäusen zu jeder von zwei Röhrchen hinzugefügt.
8. Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2.100 x g innerhalb von 1 Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Etwa 20-30 μL Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen (Abbildung 1H).

3. Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe

1. Sammeln Sie vor der Operation ein Anästhesiegerät für Kleintiere, Stereomikroskop, Lichtquelle, 50-200 μL Mikropipette mit 200 μL Mikropipettenspitzen, Wattestäbchen, ein 4-0-Nahtset und desinfizierte chirurgische Instrumente (Abbildung 2A). Autoklavieren Sie die Cooper-Schere, die Augenschere, die Erbsenzange, die Pinzette und die Nadelhalter. Nach dem Autoklavieren tauchen Sie das Gerät in eine 1%ige Povidon-Jod-Lösung (Abbildung 2A). Verwenden Sie Wattestäbchen zur Mobilisierung des Nebenhoden-Fettgewebes und zur Hämostase bei Blutungen. Verwenden Sie eine Mikropipette mit 50-200 μL Spitzen für die Inseltransplantation.
2. Verabreichung der Anästhesie an die diabetische Empfängermaus mit einem inhalativen Anästhetikum (2% Isofluran in Sauerstoff). Tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Legen Sie dann die Maus in Rückenlage (Abbildung 2B links) und entfernen Sie die Haare aus dem Bauch, um eine Infektion mit Haarschneidemaschine und/oder Enthaarungscreme zu verhindern. Desinfizieren Sie den Bauch und die Leistengegend mit mindestens drei abwechselnden Runden einer Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol (Abbildung 2B rechts). Bestätigen Sie vor der Operation die Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes. Bieten Sie intraoperative thermische Unterstützung mit einem Heizkissen und verwenden Sie einen chirurgischen Vorhang, um den sterilen chirurgischen Bereich zu sichern.
3. Schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein (Abbildung 2C links). Ein Hautschnitt von ca. 2 cm Länge wird empfohlen. Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit der Pean-Pinzette (auch eine schonende Pinzette oder ein Retraktor können verwendet werden) und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern (Abbildung 2C rechts). Verringern Sie nach der Laparotomie den Prozentsatz von Isofluran auf 1,0-1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie.
4. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus (dh der linken Seite des Bedieners) zu mobilisieren. Das linke Nebenhoden-weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich. Mobilisieren Sie das epididymale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen (Abbildung 2D links) und strecken Sie das Gewebe aus (2D rechts).
5. Verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer 200-μL-Pipettenspitze, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-ml-Röhrchen mit sanftem Pipettieren zu erfassen (Abbildung 2E links), wobei darauf zu achten ist, dass bei der Entnahme keine Inseln im Röhrchen verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft an der Spitze der Pipette absetzen (Abbildung 2E rechts).
6. Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe. Achten Sie darauf, ein übermäßiges Ausspülen des Mediums/Puffers in der Spitze zu vermeiden, und säen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe (Abbildung 2F links). Bestätigen Sie nach der Aussaat eine korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop (Abbildung 2F rechts).
7. Bedecken Sie die Inseln mit dem epididymalen weißen Fettgewebe (Abbildung 2G). Die Verwendung von Nähten oder Biobindemitteln ist nicht erforderlich.
8. Legen Sie den linken Hoden unter das epididymale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück (Abbildung 2H). Schließen Sie die Haut in zwei Schichten (Peritoneum, dann Muskel und Haut) mit einer 4-0-Naht (alle Nähte wie Nylon oder resorbierbare Nähte können verwendet werden) (Abbildung 2I). Acetylsalicylsäure (300 mg/kg; SQ) in der Nähe der Wunde für postoperative Analgesie. Legen Sie dann die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.

4. Überwachung nach Inseltransplantation (Zusammenfassung)

1. Beurteilung der therapeutischen Wirkungen der Inseltransplantation durch Überwachung des Blutzuckers, des Glukosetoleranztests und der histologischen Beurteilung am postoperativen Tag (POD) 28.
   1. Überwachen Sie den Blutzucker, einschließlich der Messungen des Blutzuckers beim Glukosetoleranztest, mit einem kleinen Blutzuckermessgerät.
   2. Sammeln Sie die Blutproben (ein wenig Mikroliter) aus der Schwanzvene. In Bezug auf die histologische Beurteilung wurden murines Insulin (zum Nachweis von transplantierten Inseln) und der von-Willebrand-Faktor (zum Nachweis von Gefäßen, was ein Beweis für Inseltransplantation ist) in transplantierten Inseln im wiedergewonnenen Nebenhodenfettgewebe durch Immunhistochemie nachgewiesen.

Ergebnisse

Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von Kontrollempfänger-Diabetikern implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm (p = 0,0023; Abbildung 3A). E...

Diskussion

Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode umfasst Techniken aus zwei verschiedenen Transplantationstechniken: intraperitoneale Inseltransplantation und intraadipöse Gewebeinseltransplantation. Da die Oberflächenmembran des epididymalen weißen Fettgewebes als das weiße Fettgewebe angesehen wird, das vom Peritoneum bedeckt ist und an den Nebenhoden befestigt ist, kann die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode anatomisch als eine Art intraperitoneale Inseltransplantation kategorisiert werden. Die Technik, mit de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor