Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

Resumo

Este método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é adequado para a detecção de ilhotas enxertadas na cavidade intraperitoneal. Notavelmente, não requer o uso de agentes bioligantes ou sutura.

Resumo

O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para diabetes mellitus grave. A cavidade intraperitoneal é tipicamente o local de transplante para este procedimento. No entanto, o transplante de ilhotas intraperitoneais tem algumas limitações, incluindo baixa eficácia do transplante, difícil capacidade de detecção do enxerto e falta de capacidade de enxertectomia para análise pós-transplante. Neste artigo, o "transplante de ilhotas cobertas de gordura", um método de transplante de ilhotas intraperitoneais que utiliza tecido adiposo branco epididimal, é usado para avaliar os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia. A simplicidade do método reside na semeadura de ilhotas no tecido adiposo branco epididimal e no uso do tecido para cobrir as ilhotas. Embora este método possa ser categorizado como uma técnica de transplante de ilhotas intraperitoneais, ele compartilha características com o transplante de ilhotas de tecido adiposo. O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura demonstra efeitos terapêuticos mais robustos do que o transplante de ilhotas de tecido adiposo, no entanto, incluindo a melhoria dos níveis de glicose no sangue e insulina plasmática e o potencial para a remoção do enxerto. Recomenda-se a adoção deste método para avaliar os mecanismos de enxerto de ilhotas em tecido adiposo branco e os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia.

Introdução

O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para pacientes com diabetes mellitus grave. Relatórios recentes têm mostrado que as taxas de independência de insulina em três anos após o transplante melhoram até 44%¹ e que aproximadamente 80% dos receptores que recebem mais de 600.000 equivalentes totais de ilhotas atingem a independência da insulina². Além disso, no mais recente relatório do Registro Colaborativo de Transplante de Ilhotas, foi revelado que os níveis de glicose no sangue em jejum foram mantidos em 60-140 mg / dL por um período de 5 anos em mais de 70% dos pacientes que foram submetidos apenas ao transplante de ilhotas. O estudo também determinou que cerca de 90% dos pacientes que receberam transplante de ilhotas isoladamente ou transplante de ilhotas após o transplante renal não desenvolveram nenhum evento hipoglicêmico grave por mais de 5 anos³.

Embora os desfechos clínicos desse tratamento tenham melhorado, algumas limitações ainda devem ser abordadas, incluindo a necessidade de estabelecer um local ideal para o transplante. O fígado é um local de transplante típico para o transplante clínico de ilhotas porque é o maior órgão que pode acomodar um alto volume de ilhotas. No entanto, em alguns pacientes, o fígado não está disponível (por exemplo, devido à hipertensão portal, hepatite e/ou cirrose⁴) e, portanto, a outros locais, incluindo o espaço subcapsular renal^5,6, bolsa omental 7,8,9,10, mesentério 11, trato gastrointestinal 12, músculo esquelético 13, tecido subcutâneo^13, medula óssea 14 e baço ¹⁵ ,^16,17, têm sido considerados como locais alternativos de transplante.

Embora o transplante intraperitoneal de ilhotas possa ser realizado facilmente sob anestesia local, tornando a cavidade intraperitoneal um local atraente para o transplante clínico de ilhotas, após o transplante, as ilhotas são dispersas por toda a cavidade intraperitoneal, dificultando a detecção do enxerto de ilhotas e a confirmação bem-sucedida do enxerto. Portanto, a cavidade intraperitoneal não é amplamente reconhecida como um local ideal de transplante clínico. Em vez disso, é frequentemente utilizado como um modelo de controle para estudos pré-clínicos para investigar a eficácia de ilhotas encapsuladas^{transplantadas 18} e de ilhotas de bioengenharia¹⁹. No entanto, uma comparação exata entre a bioengenharia e as ilhotas de controle é difícil de alcançar devido aos desafios na realização de uma avaliação precisa do enxerto.

Em contraste, o uso de tecido adiposo branco intraperitoneal na bolsa omental⁸, mesentério e outras localizações extra-hepáticas tem sido bem relatado 10,20,21,22,23 e muitos dos estudos que investigaram a função de ilhotas de bioengenharia transplantadas com tecido adiposo branco foram capazes de relatar resultados terapêuticos promissores ^{20,24,25, 26}. Como o uso de tecido adiposo epididimal facilita a detecção de ilhotas transplantadas, o "método de transplante de ilhotas cobertas de gordura", utilizando tecido adiposo epididimal, foi desenvolvido para superar as limitações do transplante de ilhotas intraperitoneais. Neste trabalho, o transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo epididimal é descrito.

Protocolo

O procedimento a seguir é executado em três etapas. O primeiro passo inclui a indução de diabetes nos camundongos receptores e o isolamento das ilhotas doadoras. A segunda etapa envolve a preparação de ilhotas antes do transplante. Na terceira etapa, é realizado o transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e a cobertura das ilhotas utilizando o tecido adiposo. Em seguida, os efeitos terapêuticos foram avaliados. O manuseio dos camundongos e os procedimentos experimentais realizados neste estudo estão em conformidade com os ''Princípios de Cuidados com Animais de Laboratório'' (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, National Institutes of Health publicação^8ª edição, 2011), e o protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Fukuoka (número de aprovação: 186018).

1. Preparação cirúrgica

1. Indução de diabetes: Induzir diabetes em camundongos machos receptores de 8-12 mg de peso corporal de 20-25 g de idade através de injeção intravenosa de solução de estreptozotocina de 18 mg/mL preparada em tampão de citrato 0,1M (180 mg/kg de peso corporal). Ratos com níveis de glicose no sangue superiores a 400 mg / dL são considerados diabéticos. Use ratos diabéticos dentro de 1 semana após a indução do diabetes antes da atrofia excessiva do tecido adiposo branco epididimal para cobrir ilhotas.
2. Isolamento de ilhotas: Realizar isolamento de ilhotas murinas um dia antes do transplante seguindo o método de Gotoh²⁷ para isolamento de ilhotas.
3. Em resumo, digerir o tecido pancreático usando solução de colagenase. Isolar ilhotas por centrifugação por gradiente de densidade utilizando uma solução de separação celular apropriada. Em seguida, cultivar ilhotas durante a noite em uma incubadora a 22 °C e 5% de CO₂ (cultura a <37 °C foi relatada para prevenir a morte de ilhotas 28,29,30,31).
   NOTA: Manuseie as culturas de ilhotas purificadas em um armário de segurança. Filtrar-esterilizar todas as soluções utilizadas para isolamento e cultura de ilhotas usando um filtro de 0,22 μm.

2. Preparação de ilhotas para transplante

1. Reúna os instrumentos e materiais apropriados, conforme indicado na Figura 1A.
2. Como enzimas digestivas como amilase e lipase podem resultar em lesões nas ilhotas isoladas e transplantadas e uma perda de ilhotas pode ocorrer por estarem presas em tecidos fibrosos contaminantes dentro da placa de cultura, antes do transplante, use fórceps para escolher a dedo quaisquer componentes extra-ilhotas do pâncreas, incluindo tecidos acinares e fibrosos (Figura 1B), sob um microscópio de dissecação. Após a colheita, use um filtro de células para filtrar células acinares únicas.
3. Transfira as ilhotas filtradas para uma nova placa de cultura contendo qualquer meio de cultura apropriado ou solução tampão (por exemplo, DMEM com baixa glicose, RPMI1640, CMRL1066 ou HBSS) suplementada com soro bovino ou albumina para evitar a fixação das ilhotas ao plástico e girar o prato para posicionar as ilhotas no centro do prato (Figura 1C). Usando uma micropipeta P200 e o microscópio, escolha as ilhotas individuais em um tubo de coleta apropriado (Figura 1D).
4. Coloque um novo filtro celular de 40 μm em cima de um tubo de plástico de 50 mL (Figura 1E esquerda e centro) e lave o filtro com meio fresco (Figura 1E à direita).
5. Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar as ilhotas ao filtro para separar as ilhotas e as células acinares únicas (Figura 1 F1 e Figura 1F2).
   NOTA: As ilhotas purificadas no filtro celular serão aproximadamente 100% puras.
6. Use fórceps para inverter o filtro em uma nova placa de cultura não tratada de 60 ou 100 mm contendo meio de cultura ou uma solução tampão apropriada suplementada com soro bovino ou albumina (Figura 1 F3 e Figura 1F4). Use meio fresco / tampão para lavar as ilhotas em um novo prato de cultura. Em seguida, adicione meio / tampão suficiente ao prato de cultura para atingir um volume total de aproximadamente 20 mL.
7. Contar as ilhotas ao microscópio e dividir o número de ilhotas igualmente entre tubos de centrífuga plástica individuais de 1,5 mL de acordo com o número de animais doadores (Figura 1G). Por exemplo, duzentos equivalentes de ilhotas de 100-200 μm (IEQ) de dois ratos seriam adicionados a cada um dos dois tubos.
8. Centrifugar as ilhotas a 2.100 x g no prazo de 1 minuto à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Cerca de 20-30 μL de solução residual normalmente permanecerão no tubo (Figura 1H).

3. Transplante de ilhotas para tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal

1. Antes da cirurgia, coletar uma máquina de anestesia para animais de pequeno porte, microscópio estéreo, fonte de luz, micropipeta de 50-200 μL com pontas de micropipeta de 200 μL, cotonetes, conjunto de sutura 4-0 e instrumentos cirúrgicos desinfetados (Figura 2A). Autoclave a tesoura de tanoeiro, tesoura oftálmica, pinça de ervilha, pinça e suportes de agulhas. Após a autoclavagem, imergir o equipamento em solução de iodopovidona a 1% (Figura 2A). Use cotonetes para mobilização do tecido adiposo branco epididimal e para hemostasia em casos de sangramento. Use uma micropipeta com pontas de 50-200 μL para transplante de ilhotas.
2. Administrar anestesia ao rato receptor diabético utilizando um agente anestésico inalado (isoflurano a 2% em oxigénio). Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos para evitar a secagem. Em seguida, coloque o rato na posição supina (Figura 2B à esquerda) e remova o cabelo do abdômen para evitar a infecção usando cortadores de cabelo e / ou creme depilatório. Desinfetar o abdome e a região inguinal utilizando pelo menos três rodadas alternadas de solução de iodopovidona seguida de etanol a 70% (Figura 2B à direita). Antes da cirurgia, confirme a profundidade da anestesia através da ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé. Forneça suporte térmico intraoperatório usando uma almofada de aquecimento e use uma cortina cirúrgica para proteger a área cirúrgica estéril.
3. Incidir a pele na área mediana inferior (Figura 2C à esquerda). Recomenda-se uma incisão na pele com aproximadamente 2 cm de comprimento. Aperte a parede abdominal esquerda com a pinça de ervilha (pinça atraumática ou afastador também pode ser usado) e puxe o tecido para o lado esquerdo do rato para fixar o campo cirúrgico (Figura 2C à direita). Após a laparotomia, diminua a porcentagem de isoflurano para 1,0-1,5% para manutenção da anestesia.
4. Use um cotonete para mobilizar o intestino delgado e grosso para o lado direito do rato (ou seja, o lado esquerdo do operador). O tecido adiposo branco epididimal esquerdo na cavidade abdominal está localizado na área inguinal esquerda. Mobilizar o tecido adiposo branco epididimal e o testículo esquerdo para fora do abdômen (Figura 2D esquerda) e esticar o tecido (2D à direita).
5. Use uma micropipeta P200 equipada com uma ponta de pipeta de 200 μL para coletar todo o volume de ilhotas de um tubo de 1,5 mL com pipetagem suave (Figura 2E à esquerda), cuidando para que nenhuma ilhota seja deixada no tubo após a coleta. Permitir que as ilhotas coletadas se depositem na ponta da pipeta por gravidade (Figura 2E à direita).
6. Coloque a ponta da micropipeta levemente sobre o tecido adiposo distendido. Tomando cuidado para evitar a lavagem excessiva do meio/tampão na ponta, semeie cuidadosamente as ilhotas no tecido (Figura 2F à esquerda). Após a semeadura, confirme a colocação correta das ilhotas sob um microscópio de dissecação (Figura 2F à direita).
7. Cobrir as ilhotas com o tecido adiposo branco epididimal (Figura 2G). O uso de suturas ou agentes bioligantes não é necessário.
8. Colocar o testículo esquerdo sob o tecido adiposo branco epididimal e devolver os tecidos à cavidade intraperitoneal (Figura 2H). Feche a pele em duas camadas (peritônio, depois músculo e pele) usando uma sutura 4-0 (quaisquer suturas como nylon ou suturas absorvíveis podem ser usadas) (Figura 2I). Injetar ácido acetilsalicílico (300 mg/kg; SQ) próximo à ferida para analgesia pós-operatória. Em seguida, coloque o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore até a recuperação completa.

4. Monitorização após transplante de ilhotas (Resumo)

1. Avaliar os efeitos terapêuticos do transplante de ilhotas por meio do monitoramento da glicemia, teste de tolerância à glicose e avaliação histológica no dia de pós-operatório (DPO) 28.
   1. Monitore a glicose no sangue, incluindo as medições de glicose no sangue no teste de tolerância à glicose, usando um pequeno medidor de glicose.
   2. Colete as amostras de sangue (um pouco de microlitros) da veia da cauda. Em relação à avaliação histológica, a insulina murina (para detecção de ilhotas enxertadas) e o fator de von Willebrand (para detecção de vasos, que é uma evidência de enxerto de ilhotas) foram detectados em ilhotas transplantadas no tecido adiposo epididimal recuperado por imuno-histoquímica.

Resultados

Para comparar a eficácia do transplante do transplante de ilhotas cobertas de gordura com a do transplante de ilhotas intraperitoneais, o mesmo número de ilhotas foi implantado no peritônio no espaço paracólico esquerdo dos animais diabéticos receptores de controle. Observou-se que os níveis de glicose no sangue de camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura diminuíram gradual e significativamente em comparação com camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais (p = 0,0023;

Discussão

O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura incorpora técnicas de duas técnicas de transplante diferentes: transplante de ilhotas intraperitoneais e transplante de ilhotas de tecido adiposo. Como a membrana superficial do tecido adiposo branco epididimal é considerada o tecido adiposo branco que é coberto pelo peritônio e que está ligado ao epidídimo, o método de transplante de ilhotas cobertas de gordura pode ser anatomicamente categorizado como um tipo de transplante de ilhotas intraperitoneais. A t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor