Transplantation d’îlots pancréatiques couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire

Résumé

Cette méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse convient à la détection des îlots greffés dans la cavité intrapéritonéale. Notamment, il ne nécessite pas l’utilisation d’agents bioliants ou de suture.

Résumé

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie de remplacement cellulaire pour le diabète sucré sévère. La cavité intrapéritonéale est généralement le site de transplantation pour cette procédure. Cependant, la transplantation intrapéritonéale d’îlots pancréales présente certaines limites, notamment une faible efficacité de la transplantation, une capacité difficile de détection du greffon et un manque de capacité de greffectomie pour l’analyse post-transplantation. Dans cet article, la « transplantation d’îlots couverts de graisse », une méthode de transplantation d’îlots intrapéritonéaux qui utilise du tissu adipeux blanc épididymaire, est utilisée pour évaluer les effets thérapeutiques des îlots bio-modifiés. La simplicité de la méthode réside dans l’ensemencement des îlots sur le tissu adipeux blanc épididymaire et l’utilisation du tissu pour couvrir les îlots. Bien que cette méthode puisse être classée comme une technique de transplantation d’îlots intrapéritonéaux, elle partage des caractéristiques avec la transplantation intra-adipeuse d’îlots pancréteux. La méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse démontre toutefois des effets thérapeutiques plus robustes que la transplantation intra-adipeuse d’îlots, y compris l’amélioration de la glycémie et des taux plasmatiques d’insuline et le potentiel d’élimination du greffon. Nous recommandons l’adoption de cette méthode pour évaluer les mécanismes de greffe d’îlots dans le tissu adipeux blanc et les effets thérapeutiques des îlots issus de la bioingénierie.

Introduction

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie de remplacement cellulaire pour les patients atteints de diabète sucré sévère. Des rapports récents ont montré que les taux d’insuline autonome trois ans après la transplantation s’améliorent jusqu’à 44 %¹ et qu’environ 80 % des receveurs qui reçoivent plus de 600 000 équivalents îlots pancréatiques atteignent l’indépendance insulinique². En outre, dans le plus récent rapport du registre collaboratif de transplantation d’îlots, il a été révélé que la glycémie à jeun était maintenue à 60-140 mg / dL pendant une période de 5 ans chez plus de 70% des patients qui ont subi une greffe d’îlots pancréatiques seuls. L’étude a également déterminé qu’environ 90% des patients ayant reçu une greffe d’îlots pancréatiques seuls ou une transplantation d’îlots après une greffe de rein n’ont pas développé d’événements hypoglycémiques graves pendant plus de 5 ans³.

Bien que les résultats cliniques de ce traitement se soient améliorés, certaines limites doivent encore être prises en compte, notamment la nécessité d’établir un site de transplantation optimal. Le foie est un site de transplantation typique pour la transplantation clinique d’îlots pancréatiques, car c’est le plus grand organe pouvant accueillir un volume élevé d’îlots. Cependant, chez certains patients, le foie n’est pas disponible (par exemple, en raison d’une hypertension portale, d’une hépatite et/ou d’une cirrhose⁴) et donc d’autres sites, y compris l’espace sous-capsulaire rénal^5,6, la poche omentale 7,8,9,10, le mésentère 11, le tractus gastro-intestinal 12, le muscle squelettique 13, le tissu sous-cutané 13^, la moelle osseuse 14 et la rate ¹⁵ ,^16,17, ont été considérés comme des sites de transplantation alternatifs.

Bien que la transplantation intrapéritonéale d’îlots puisse être effectuée facilement sous anesthésie locale, ce qui fait de la cavité intrapéritonéale un site attrayant pour la transplantation clinique d’îlots, lors de la transplantation, les îlots sont dispersés dans toute la cavité intrapéritonéale, ce qui rend difficile la détection de la greffe d’îlots et la confirmation réussie de la greffe. Par conséquent, la cavité intrapéritonéale n’est pas largement reconnue comme un site de transplantation clinique idéal. Au lieu de cela, il est fréquemment utilisé comme modèle de contrôle pour les études précliniques visant à étudier l’efficacité des îlots encapsulés^{transplantés 18} et des îlots¹⁹ issus de la bioingénierie. Cependant, une comparaison exacte entre les îlots issus de la bioingénierie et les îlots témoins est difficile à réaliser en raison des défis liés à la réalisation d’une évaluation précise de la greffe.

En revanche, l’utilisation de tissu adipeux blanc intrapéritonéal dans la poche omentale⁸, le mésentère et d’autres emplacements extrahépatiques a été bien rapportée 10,20,21,22,23 et de nombreuses études portant sur la fonction des îlots issus de la bioingénierie transplantés à l’aide de tissu adipeux blanc ont pu rapporter des résultats thérapeutiques prometteurs^{20,24,25, 26}. Comme l’utilisation de tissu adipeux épididymaire facilite la détection des îlots transplantés, la « méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse », utilisant du tissu adipeux épididymaire, a été développée pour surmonter les limites de la transplantation intrapéritonéale d’îlots. Dans cet article, la transplantation d’îlots couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux épididymaire est décrite.

Protocole

La procédure suivante est effectuée en trois étapes. La première étape comprend l’induction du diabète chez les souris receveuses et l’isolement des îlots donneurs. La deuxième étape consiste à préparer les îlots avant la transplantation. Dans la troisième étape, la transplantation d’îlots sur le tissu adipeux épididymaire et le revêtement des îlots à l’aide du tissu adipeux est effectuée. Après cela, les effets thérapeutiques ont été évalués. La manipulation des souris et les procédures expérimentales effectuées dans cette étude sont conformes aux « Principes de soin des animaux de laboratoire » (Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publication 8^e édition des National Institutes of Health, 2011), et le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Fukuoka (numéro d’approbation: 186018).

1. Préparation chirurgicale

1. Induction du diabète : Induire le diabète chez des souris mâles receveuses âgées de 8 à 12 semaines pesant 20 à 25 g par injection intraveineuse de solution de streptozotocine de 18 mg/mL préparée dans un tampon de citrate 0,1 M (180 mg/kg de poids corporel). Les souris dont la glycémie dépasse 400 mg / dL sont considérées comme diabétiques. Utilisez des souris diabétiques dans la semaine 1 après l’induction du diabète avant une atrophie excessive du tissu adipeux blanc épididymaire pour couvrir les îlots.
2. Isolement des îlots : Effectuer l’isolement des îlots murins un jour avant la transplantation en suivant la méthode²⁷ de Gotoh pour l’isolement des îlots.
3. En bref, digérer le tissu pancréatique en utilisant une solution de collagénase. Isoler les îlots par centrifugation à gradient de densité à l’aide d’une solution de séparation cellulaire appropriée. Ensuite, les îlots de culture passent la nuit dans un incubateur à 22 °C et 5% de CO₂ (la culture à <37 °C a été signalée pour prévenir la mort des îlots 28,29,30,31).
   REMARQUE: Manipulez les cultures d’îlots purifiées dans une armoire de sécurité. Filtrer-stériliser toutes les solutions utilisées pour l’isolation et la culture des îlots à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.

2. Préparation des îlots pour la transplantation

1. Rassemblez les instruments et le matériel appropriés, comme indiqué à la figure 1A.
2. Étant donné que les enzymes digestives telles que l’amylase et la lipase peuvent endommager les îlots isolés et transplantés et qu’une perte d’îlots peut se produire après avoir été piégés dans des tissus fibreux contaminants dans la boîte de culture, avant la transplantation, utilisez des pinces pour choisir manuellement tous les composants extra-îlots du pancréas, y compris les tissus acineux et fibreux (Figure 1B), sous un microscope à dissection. Après la cueillette, utilisez une passoire cellulaire pour filtrer les cellules acineuses individuelles.
3. Transférer les îlots filtrés dans une nouvelle boîte de culture contenant tout milieu de culture ou solution tampon approprié (p. ex. DMEM à faible teneur en glucose, RPMI1640, CMRL1066 ou HBSS) complété par du sérum ou de l’albumine bovine pour empêcher la fixation des îlots au plastique et agiter la capsule pour positionner les îlots au centre de la boîte (figure 1C). À l’aide d’une micropipette P200 et du microscope, prélever les îlots individuels dans un tube collecteur approprié (figure 1D).
4. Placez une nouvelle crépine cellulaire de 40 μm sur un tube en plastique de 50 ml (figure 1E à gauche et au centre) et lavez le filtre avec un milieu frais (figure 1E à droite).
5. Utilisez une pipette de 1000 μL pour ajouter les îlots à la crépine afin de séparer les îlots et les cellules acineuses simples (Figure 1 F1 et Figure 1F2).
   REMARQUE: Les îlots purifiés sur la passoire cellulaire seront purs à environ 100%.
6. Utiliser une pince pour retourner la passoire sur une nouvelle boîte de culture non traitée de 60 ou 100 mm contenant un milieu de culture ou une solution tampon appropriée additionnée de sérum ou d’albumine bovine (figure 1 F3 et figure 1F4). Utilisez un milieu / tampon frais pour rincer les îlots dans un nouveau plat de culture. Ajoutez ensuite suffisamment de milieu/tampon à la capsule de culture pour atteindre un volume total d’environ 20 mL.
7. Compter les îlots au microscope et diviser le nombre d’îlots également entre les tubes à centrifuger en plastique individuels de 1,5 mL en fonction du nombre d’animaux donneurs (figure 1G). Par exemple, deux cents équivalents d’îlots de 100 à 200 μm (IEQ) provenant de deux souris seraient ajoutés à chacun des deux tubes.
8. Centrifuger les îlots à 2 100 x g en 1 minute à température ambiante et jeter le surnageant. Environ 20 à 30 μL de solution résiduelle restent généralement dans le tube (Figure 1H).

3. Transplantation d’îlots sur du tissu adipeux épididymaire et recouvert de tissu adipeux blanc épididymaire

1. Avant la chirurgie, prélevez un appareil d’anesthésie pour petits animaux, un stéréomicroscope, une source lumineuse, une micropipette de 50 à 200 μL avec des pointes de micropipette de 200 μL, des cotons-tiges, un ensemble de suture 4-0 et des instruments chirurgicaux désinfectés (figure 2A). Autoclave les ciseaux de tonnelier, les ciseaux ophtalmiques, les pinces à pois, les pinces à épiler et les porte-aiguilles. Après l’autoclavage, immerger l’équipement dans une solution de povidone iodée à 1 % (figure 2A). Utilisez des cotons-tiges pour la mobilisation du tissu adipeux blanc épididymaire et pour l’hémostase en cas de saignement. Utilisez une micropipette avec un embout de 50 à 200 μL pour la transplantation d’îlots.
2. Administrer l’anesthésie à la souris receveuse diabétique à l’aide d’un agent anesthésique inhalé (2% d’isoflurane dans l’oxygène). Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement. Placez ensuite la souris en décubitus dorsal (Figure 2B à gauche) et retirez les poils de l’abdomen pour prévenir l’infection à l’aide d’une tondeuse à cheveux et/ou d’une crème dépilatoire. Désinfecter l’abdomen et la région inguinale en utilisant au moins trois cycles alternés d’une solution de povidone iodée suivie d’éthanol à 70 % (figure 2B droite). Avant la chirurgie, confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. Fournir un soutien thermique peropératoire à l’aide d’un coussin chauffant et utiliser un champ chirurgical pour sécuriser la zone chirurgicale stérile.
3. Inciser la peau au niveau de la zone médiane inférieure (Figure 2C à gauche). Une incision cutanée d’environ 2 cm de longueur est recommandée. Serrez la paroi abdominale gauche avec la pince de Pean (une pince atraumatique ou un rétracteur peut également être utilisé) et tirez le tissu vers le côté gauche de la souris pour sécuriser le champ chirurgical (Figure 2C droite). Après laparotomie, diminuer le pourcentage d’isoflurane à 1,0-1,5% pour l’entretien de l’anesthésie.
4. Utilisez un coton-tige pour mobiliser l’intestin grêle et le gros intestin vers le côté droit de la souris (c.-à-d. le côté gauche de l’opérateur). Le tissu adipeux blanc épididymaire gauche dans la cavité abdominale est situé dans la région inguinale gauche. Mobiliser le tissu adipeux blanc épididymaire et le testicule gauche à l’extérieur de l’abdomen (Figure 2D gauche) et étirer le tissu (2D droite).
5. Utilisez une micropipette P200 munie d’une pointe de pipette de 200 μL pour recueillir tout le volume des îlots d’un tube de 1,5 mL muni d’un pipetage doux (figure 2E à gauche), en veillant à ce qu’il ne reste aucun îlot dans le tube lors de la collecte. Laisser les îlots collectés se déposer à l’extrémité de la pipette par gravité (figure 2E droite).
6. Placez légèrement l’embout de la micropipette sur le tissu adipeux distendu. En prenant soin d’éviter un rinçage excessif du milieu/tampon à l’extrémité, ensemencez soigneusement les îlots sur le tissu (figure 2F à gauche). Après l’ensemencement, confirmer le placement correct des îlots sous un microscope à dissection (figure 2F droite).
7. Couvrir les îlots avec le tissu adipeux blanc épididymaire (Figure 2G). L’utilisation de sutures ou d’agents bioliants n’est pas nécessaire.
8. Placez le testicule gauche sous le tissu adipeux blanc épididymaire et replacez les tissus dans la cavité intrapéritonéale (Figure 2H). Fermez la peau en deux couches (péritoine, puis muscle et peau) à l’aide d’une suture 4-0 (toutes les sutures telles que le nylon ou les sutures résorbables peuvent être utilisées) (Figure 2I). Injecter de l’acide acétylsalicylique (300 mg/kg; SQ) près de la plaie pour l’analgésie postopératoire. Placez ensuite la souris sous une lampe chauffante et surveillez jusqu’à récupération complète.

4. Surveillance après la transplantation d’îlots pancréatiques (résumé)

1. Évaluer les effets thérapeutiques de la transplantation d’îlots pancréatiques en surveillant la glycémie, le test de tolérance au glucose et l’évaluation histologique au jour postopératoire (POD) 28.
   1. Surveiller la glycémie, y compris les mesures de la glycémie au test de tolérance au glucose, à l’aide d’un petit glucomètre.
   2. Prélevez les échantillons de sang (un peu de microlitres) dans la veine de la queue. En ce qui concerne l’évaluation histologique, l’insuline murine (pour détecter les îlots greffés) et le facteur von Willebrand (pour la détection des vaisseaux, ce qui est une preuve de la greffe d’îlots) ont été détectés dans les îlots transplantés dans le tissu adipeux épididymaire récupéré par immunohistochimie.

Résultats

Pour comparer l’efficacité de la transplantation d’îlots couverts de graisse à celle après la transplantation intrapéritonéale d’îlots, le même nombre d’îlots a été implanté sur le péritoine à l’espace paracolique gauche des animaux diabétiques receveurs témoins. On a observé que la glycémie des souris ayant subi une transplantation d’îlots couverts de graisse diminuait graduellement et significativement par rapport aux souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux (p = 0,0023;

Discussion

La méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse intègre des techniques de deux techniques de transplantation différentes: la transplantation intrapéritonéale d’îlots et la transplantation intra-adipeuse d’îlots adipeux. Comme la membrane superficielle du tissu adipeux blanc épididymaire est considérée comme le tissu adipeux blanc qui est recouvert par le péritoine et qui est attaché à l’épididyme, la méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse peut être anatomiquement clas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor