Trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo blanco epididimario

Resumen

Este método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es adecuado para la detección de islotes injertados en la cavidad intraperitoneal. En particular, no requiere el uso de agentes bioaglutinantes o suturas.

Resumen

El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus grave. La cavidad intraperitoneal suele ser el sitio de trasplante para este procedimiento. Sin embargo, el trasplante de islotes intraperitoneales tiene algunas limitaciones, incluida la eficacia deficiente del trasplante, la capacidad de detección difícil del injerto y la falta de capacidad de injertectomía para el análisis posterior al trasplante. En este documento, el "trasplante de islotes cubiertos de grasa", un método de trasplante de islotes intraperitoneales que utiliza tejido adiposo blanco epididimario, se utiliza para evaluar los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería. La simplicidad del método radica en la siembra de islotes en el tejido adiposo blanco del epidídimo y el uso del tejido para cubrir los islotes. Si bien este método se puede clasificar como una técnica de trasplante de islotes intraperitoneal, comparte características con el trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Sin embargo, el método de trasplante de islotes cubiertos de grasa demuestra efectos terapéuticos más sólidos que el trasplante de islotes de tejido intraadiposo, incluida la mejora de los niveles de glucosa en sangre e insulina plasmática y el potencial de extracción del injerto. Recomendamos la adopción de este método para evaluar los mecanismos de injerto de islotes en tejido adiposo blanco y los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería.

Introducción

El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para pacientes con diabetes mellitus grave. Informes recientes han demostrado que las tasas de independencia de la insulina a los tres años después del trasplante mejoran hasta un 44%¹ y que aproximadamente el 80% de los receptores que reciben más de 600.000 equivalentes totales de islotes logran la independencia de la insulina². Además, en el informe más reciente del Registro Colaborativo de Trasplantes de Islotes, se reveló que los niveles de glucosa en sangre en ayunas se mantuvieron en 60-140 mg / dL durante un período de 5 años en más del 70% de los pacientes que se sometieron solo a un trasplante de islotes. El estudio también determinó que alrededor del 90% de los pacientes que recibieron trasplante de islotes solo o trasplante de islotes después del trasplante de riñón no desarrollaron ningún evento hipoglucémico grave durante más de 5 años³.

Aunque los resultados clínicos de este tratamiento han ido mejorando, aún deben abordarse algunas limitaciones, incluida la necesidad de establecer un sitio de trasplante óptimo. El hígado es un sitio de trasplante típico para el trasplante clínico de islotes porque es el órgano más grande que puede acomodar un gran volumen de islotes. Sin embargo, en algunos pacientes el hígado no está disponible (p. ej., debido a hipertensión portal, hepatitis y/o cirrosis⁴) y, por lo tanto, otros sitios, incluyendo el espacio subcapsular renal^5,6, la bolsa omental 7,8,9,10, el mesenterio 11, el tracto gastrointestinal 12, el músculo esquelético 13, el tejido subcutáneo 13^, la médula ósea 14 y el bazo ¹⁵ ,^16,17, han sido considerados como sitios alternativos de trasplante.

Aunque el trasplante de islotes intraperitoneales se puede realizar fácilmente bajo anestesia local, lo que hace que la cavidad intraperitoneal sea un sitio atractivo para el trasplante clínico de islotes, después del trasplante, los islotes se dispersan por toda la cavidad intraperitoneal, lo que dificulta la detección del injerto de islotes y la confirmación exitosa del injerto. Por lo tanto, la cavidad intraperitoneal no es ampliamente reconocida como un sitio de trasplante clínico ideal. En cambio, se utiliza con frecuencia como modelo de control para estudios preclínicos para investigar la efectividad de los islotes encapsulados^{trasplantados 18} y los islotes de bioingeniería¹⁹. Sin embargo, es difícil lograr una comparación exacta entre la bioingeniería y los islotes de control debido a los desafíos para realizar una evaluación precisa del injerto.

En contraste, el uso de tejido adiposo blanco intraperitoneal en la bolsa omental⁸, mesenterio y otras localizaciones extrahepáticas ha sido bien reportado 10,20,21,22,23 y muchos de los estudios que investigaron la función de los islotes de bioingeniería trasplantados usando tejido adiposo blanco pudieron reportar resultados terapéuticos prometedores ^{20,24,25, 26}. Como el uso de tejido adiposo epididimario facilita la detección de islotes trasplantados, se desarrolló el "método de trasplante de islotes cubiertos de grasa", que utiliza tejido adiposo epididimario, para superar las limitaciones del trasplante de islotes intraperitoneales. En este trabajo, se describe el trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo epididimario.

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Protocolo

El siguiente procedimiento se realiza en tres pasos. El primer paso incluye la inducción de diabetes en los ratones receptores y el aislamiento de los islotes donantes. El segundo paso implica la preparación de los islotes antes del trasplante. En el tercer paso, se realiza el trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento de los islotes utilizando el tejido adiposo. Después de eso, se evaluaron los efectos terapéuticos. El manejo de los ratones y los procedimientos experimentales realizados en este estudio cumplen con los "Principios de cuidado de animales de laboratorio" (Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicación de los Institutos Nacionales de Salud^8ª edición, 2011), y el protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fukuoka (número de aprobación: 186018).

1. Preparación quirúrgica

1. Inducción de diabetes: Inducir diabetes en ratones machos receptores de 20-25 g de peso corporal, de 8-12 semanas de edad, mediante inyección intravenosa de solución de estreptozotocina de 18 mg / ml preparada en tampón de citrato 0.1M (180 mg / kg de peso corporal). Los ratones con niveles de glucosa en sangre superiores a 400 mg / dL se consideran diabéticos. Use ratones diabéticos dentro de 1 semana después de la inducción de diabetes antes de la atrofia excesiva del tejido adiposo blanco epididimario para cubrir los islotes.
2. Aislamiento de islotes: Realizar aislamiento de islotes murinos un día antes del trasplante siguiendo el método²⁷ de Gotoh para el aislamiento de islotes.
3. En resumen, digiera el tejido pancreático usando solución de colagenasa. Aislar los islotes mediante centrifugación por gradiente de densidad utilizando una solución de separación celular adecuada. Luego, cultive islotes durante la noche en una incubadora a 22 °C y 5% de_CO2 (se ha informado que el cultivo a <37 °C previene la muerte de los islotes 28,29,30,31).
   NOTA: Manipule los cultivos de islotes purificados en un armario de seguridad. Filtrar-esterilizar todas las soluciones utilizadas para el aislamiento y cultivo de islotes utilizando un filtro de 0,22 μm.

2. Preparación de islotes para trasplante

1. Reúna los instrumentos y materiales apropiados como se indica en la Figura 1A.
2. Como las enzimas digestivas como la amilasa y la lipasa pueden provocar lesiones en los islotes aislados y trasplantados y puede producirse una pérdida de islotes al quedar atrapados en tejidos fibrosos contaminantes dentro de la placa de cultivo, antes del trasplante, use fórceps para seleccionar a mano cualquier componente adicional de los islotes del páncreas, incluidos los tejidos acinares y fibrosos (Figura 1B), bajo un microscopio de disección. Después de la recolección, use un colador de celdas para filtrar las células acinares individuales.
3. Transfiera los islotes filtrados a una nueva placa de cultivo que contenga cualquier medio de cultivo o solución tampón apropiada (por ejemplo, DMEM con bajo nivel de glucosa, RPMI1640, CMRL1066 o HBSS) suplementada con suero bovino o albúmina para evitar la fijación de islotes al plástico y agite el plato para colocar los islotes en el centro del plato (Figura 1C). Usando una micropipeta P200 y el microscopio, escoja los islotes individuales en un tubo de recolección apropiado (Figura 1D).
4. Coloque un filtro celular nuevo de 40 μm encima de un tubo de plástico de 50 ml (Figura 1E izquierda y centro) y lave el filtro con medio nuevo (Figura 1E derecha).
5. Utilice una pipeta de 1000 μL para añadir los islotes al colador para separar los islotes y las células acinares individuales (Figura 1 F1 y Figura 1F2).
   NOTA: Los islotes purificados en el filtro celular serán aproximadamente 100% puros.
6. Utilice fórceps para invertir el colador en una nueva placa de cultivo no tratada de 60 o 100 mm de tamaño que contenga medio de cultivo o una solución tampón adecuada complementada con suero bovino o albúmina (Figura 1 F3 y Figura 1F4). Use medio fresco / tampón para enjuagar los islotes en un nuevo plato de cultivo. Luego agregue suficiente medio/tampón a la placa de cultivo para alcanzar un volumen total de aproximadamente 20 ml.
7. Contar los islotes bajo un microscopio y dividir el número de islotes por igual entre tubos centrífugos de plástico individuales de 1,5 ml de acuerdo con el número de animales donantes (Figura 1G). Por ejemplo, doscientos equivalentes de islotes (IEQ) de 100-200 μm de dos ratones se agregarían a cada uno de los dos tubos.
8. Centrifugar los islotes a 2.100 x g en 1 minuto a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Alrededor de 20-30 μL de solución residual normalmente permanecerán en el tubo (Figura 1H).

3. Trasplante de islotes sobre tejido adiposo epididimario y recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario

1. Antes de la cirugía, recoja una máquina de anestesia para animales pequeños, microscopio estéreo, fuente de luz, micropipeta de 50-200 μL con puntas de micropipeta de 200 μL, hisopos de algodón, un juego de sutura 4-0 e instrumentos quirúrgicos desinfectados (Figura 2A). Autoclave las tijeras de cobre, tijeras oftálmicas, pinzas de Pean, pinzas y portaagujas. Después del autoclave, sumerja el equipo en una solución de povidona yodada al 1% (Figura 2A). Use hisopos de algodón para la movilización del tejido adiposo blanco del epidídimo y para la hemostasia en casos de sangrado. Utilice una micropipeta con puntas de 50-200 μL para el trasplante de islotes.
2. Administrar anestesia al ratón receptor diabético utilizando un agente anestésico inhalado (2% de isoflurano en oxígeno). Aplique lubricante oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque. Luego coloque el ratón en posición supina (Figura 2B izquierda) y retire el vello del abdomen para prevenir la infección usando cortapelos y/o crema depilatoria. Desinfecte el abdomen y la región inguinal utilizando al menos tres rondas alternas de una solución de povidona yodada seguida de etanol al 70% (Figura 2B derecha). Antes de la cirugía, confirme la profundidad de la anestesia a través de la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie. Proporcione soporte térmico intraoperatorio usando una almohadilla térmica y use una cortina quirúrgica para asegurar el área quirúrgica estéril.
3. Incise la piel en el área mediana inferior (Figura 2C izquierda). Se recomienda una incisión en la piel de aproximadamente 2 cm de longitud. Sujete la pared abdominal izquierda con los fórceps de Pean (también se pueden usar fórceps atraumáticos o retractor) y tire del tejido hacia el lado izquierdo del ratón para asegurar el campo quirúrgico (Figura 2C derecha). Después de la laparotomía, disminuya el porcentaje de isoflurano a 1.0-1.5% para el mantenimiento de la anestesia.
4. Use un hisopo de algodón para movilizar el intestino delgado y grueso hacia el lado derecho del ratón (es decir, el lado izquierdo del operador). El tejido adiposo blanco del epidídimo izquierdo en la cavidad abdominal se encuentra en el área inguinal izquierda. Movilizar el tejido adiposo blanco del epidídimo y el testículo izquierdo hacia el exterior del abdomen (Figura 2D izquierda) y estirar el tejido (2D derecha).
5. Utilice una micropipeta P200 equipada con una punta de pipeta de 200 μL para recoger todo el volumen de islotes de un tubo de 1,5 ml con pipeteo suave (figura 2E izquierda), teniendo cuidado de que no queden islotes en el tubo en el momento de la recolección. Permitir que los islotes recogidos se asienten en la punta de la pipeta por gravedad (Figura 2e derecha).
6. Coloque la punta de la micropipeta ligeramente sobre el tejido adiposo distendido. Teniendo cuidado de evitar el lavado excesivo del medio/tampón en la punta, siembre cuidadosamente los islotes en el tejido (Figura 2F izquierda). Después de la siembra, confirme una colocación correcta de los islotes bajo un microscopio de disección (Figura 2F derecha).
7. Cubrir los islotes con el tejido adiposo blanco del epidídimo (Figura 2G). No es necesario el uso de suturas o agentes bioaglutinantes.
8. Coloque el testículo izquierdo debajo del tejido adiposo blanco del epidídimo y devuelva los tejidos a la cavidad intraperitoneal (Figura 2H). Cierre la piel en dos capas (peritoneo, luego músculo y piel) usando una sutura 4-0 (se pueden usar suturas como nylon o suturas absorbibles) (Figura 2I). Inyecte ácido acetilsalicílico (300 mg/kg; SQ) cerca de la herida para analgesia postoperatoria. Luego coloque el mouse debajo de una lámpara de calor y monitoree hasta que se recupere por completo.

4. Monitorización después del trasplante de islotes (Resumen)

1. Evaluar los efectos terapéuticos del trasplante de islotes mediante monitorización de la glucemia, prueba de tolerancia a la glucosa y evaluación histológica en el día postoperatorio (POD) 28.
   1. Controle la glucosa en sangre, incluidas las mediciones de glucosa en sangre en la prueba de tolerancia a la glucosa, utilizando un pequeño medidor de glucosa.
   2. Recoja las muestras de sangre (un poco de microlitros) de la vena de la cola. En cuanto a la evaluación histológica, se detectaron insulina murina (para detectar islotes injertados) y factor von Willebrand (para detección de vasos, que es evidencia para injerto de islotes) en islotes trasplantados en el tejido adiposo epididimario recuperado mediante inmunohistoquímica.

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Resultados

Para comparar la eficacia del trasplante del trasplante de islotes cubiertos de grasa con la del trasplante intraperitoneal de islotes, se implantó el mismo número de islotes en el peritoneo en el espacio paracólico izquierdo de los animales diabéticos receptores de control. Se observó que los niveles de glucosa en sangre de ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa disminuyeron gradual y significativamente en comparación con los ratones trasplantados con islotes intraperitoneales (p = 0,0023;

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Discusión

El método de trasplante de islotes cubiertos de grasa incorpora técnicas de dos técnicas de trasplante diferentes: trasplante de islotes intraperitoneales y trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Como la membrana superficial del tejido adiposo blanco del epidídimo se considera el tejido adiposo blanco que está cubierto por el peritoneo y que está unido al epidídimo, el método de trasplante de islotes cubierto de grasa se puede clasificar anatómicamente como un tipo de trasplante de islotes intraperitoneal...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor