부고환 백색 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식

요약

이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.

초록

췌도 이식은 중증 당뇨병에 대한 세포 대체 요법입니다. 복강 내강은 일반적으로이 절차의 이식 부위입니다. 그러나 복강 내 췌도 이식은 이식 효능이 좋지 않고 이식편 검출 능력이 어렵고 이식 후 분석을위한 이식 절제술 능력이 부족하다는 점에서 몇 가지 한계가 있습니다. 이 논문에서는 부고환 백색 지방 조직을 활용한 복강 내 췌도 이식 방법인 "지방으로 덮인 췌도 이식"을 사용하여 생체 공학 췌도의 치료 효과를 평가합니다. 이 방법의 단순성은 부고환 백색 지방 조직에 섬을 뿌리고 조직을 사용하여 섬을 덮는 데 있습니다. 이 방법은 복강 내 췌도 이식 기술로 분류 할 수 있지만 지방 내 조직 췌도 이식과 특성을 공유합니다. 그러나 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 혈당 및 혈장 인슐린 수치의 개선과 이식편 제거 가능성을 포함하여 지방 내 조직 췌도 이식보다 더 강력한 치료 효과를 보여줍니다. 백색 지방 조직으로의 췌도 생착 메커니즘과 생체 공학 섬의 치료 효과를 평가하기 위해이 방법을 채택하는 것이 좋습니다.

서문

췌도 이식은 중증 당뇨병 환자를위한 세포 대체 요법입니다. 최근 보고서에 따르면 이식 후 3년 후 인슐린 자립율은 최대 44%1까지 향상되며, 총 췌도 등가물 600,000건 이상을 투여받은 수혜자의 약 80%가 인슐린 자립성을 달성^합니다2. 또한, 가장 최근의 협력 췌도 이식 등록 보고서에서 췌도 이식만 받은 환자의 70% 이상에서 공복 혈당 수치가 5년 동안 60-140mg/dL로 유지되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 또한 췌도 이식 단독 또는 신장 이식 후 췌도 이식을받은 환자의 약 90 %가 5 년 이상 심각한 저혈당 사건을 일으키지 않았다고 결정했습니다³.

이 치료의 임상 결과가 개선되고 있지만 최적의 이식 부위를 구축해야 할 필요성을 포함하여 몇 가지 제한 사항을 해결해야 합니다. 간은 많은 양의 췌도를 수용할 수 있는 가장 큰 기관이기 때문에 임상 췌도 이식을 위한 전형적인 이식 부위입니다. 그러나, 일부 환자에서는 간을 이용할 수 없고(예를 들어, 문맥 고혈압, 간염 및/또는 간경변^{4로 인해}) 따라서 신장 피막하 공간^5,6, 안주머니 7,8,9,10^, 장간막(¹¹), 위장관(12), 골격근(13), 피하 조직(13), 골수(¹⁴) 및 비장(¹⁵)을 포함하는 다른 부위 ,^16,17은 대체 이식 부위로 간주되었습니다.

복강 내 췌도 이식은 국소 마취하에 쉽게 수행 할 수있어 복강 내 강이 임상 췌도 이식을위한 매력적인 부위가되지만, 이식시 췌도가 복강 전체에 분산되어 췌도 생착 검출 및 성공적인 생착 확인이 어렵습니다. 따라서, 복강 내 공동은 이상적인 임상 이식 부위로 널리 인식되지 않는다. 대신, 이식된 캡슐화된 섬(¹⁸ ) 및 생체공학적 섬(¹⁹)의 효과를 조사하기 위한 전임상 연구를 위한 대조 모델로서 자주 활용된다. 그러나 생체 공학과 대조 섬 간의 정확한 비교는 정확한 생착 평가를 수행하는 데 어려움이 있기 때문에 달성하기 어렵습니다.

대조적으로, omental pouch⁸, 장간막 및 기타 간외 위치에서 복강 내 백색 지방 조직의 사용은 잘 보고되었으며10,20,21,22,23 백색 지방 조직을 사용하여 이식된 생체 공학 섬의 기능을 조사하는 많은 연구에서 유망한 치료 결과를 보고할 수 있었습니다^{20,24,25, 26}. 부고환 지방 조직의 사용이 이식 된 췌도의 검출을 용이하게함에 따라 복강 내 섬 이식의 한계를 극복하기 위해 부고환 지방 조직을 활용 한 "지방 피복 섬 이식 방법"이 개발되었습니다. 본 논문에서는 부고환 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식에 대해 설명한다.

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프로토콜

다음 절차는 세 단계로 수행됩니다. 첫 번째 단계는 수용자 마우스에서 당뇨병의 유도와 기증자 섬의 분리를 포함합니다. 두 번째 단계는 이식 전에 췌도를 준비하는 것입니다. 제 3 단계에서는 부고환 지방 조직에 췌도 이식을 실시하고 지방 조직을 이용하여 췌도를 덮는다. 그 후, 치료 효과를 평가하였다. 본 연구에서 실시한 마우스의 취급 및 실험 절차는 '실험동물 관리의 원리'(실험동물의 관리 및 이용 지침, 국립보건원 간행물 제^8판, 2011)에 준거하며, 실험 프로토콜은 후쿠오카대학 동물관리이용위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: 186018).

1. 수술 준비

1. 당뇨병 유도 : 0.1M 구연산염 완충액 (180mg / kg 체중)에서 제조 한 18mg / mL 스트렙토 조토신 용액 18mg / mL 정맥 주사를 통해 체중 20-25g, 8-12 주령 수컷 마우스에서 당뇨병을 유도합니다. 혈당 수치가 400mg/dL를 초과하는 마우스는 당뇨병으로 간주됩니다. 당뇨병 유발 후 1주일 이내에 당뇨병 마우스를 사용하여 섬을 덮기 위해 부고환 백색 지방 조직의 과도한 위축을 일으킨다.
2. 췌도 분리: 췌도 분리를 위한 Gotoh의 방법²⁷ 에 따라 이식 하루 전에 쥐 췌도 분리를 수행합니다.
3. 간단히 말해서, 콜라게나제 용액을 사용하여 췌장 조직을 소화하십시오. 적절한 세포 분리 용액을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 췌도를 분리합니다. 그 다음 22°C 및 5%_CO2의 배양기에서 밤새 췌도 배양(<37°C에서 배양하면 28,29,30,31 섬이 사멸하는 것을 방지하는 것으로 보고되었다).
   알림: 정제된 췌도 배양액을 안전 캐비닛에서 취급하십시오. 췌도 분리 및 배양에 사용되는 모든 용액을 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.

2. 이식을위한 췌도의 준비

1. 그림 1A에 표시된대로 적절한 도구와 재료를 수집하십시오.
2. 아밀라아제 및 리파아제와 같은 소화 효소는 분리 및 이식된 섬에 손상을 줄 수 있고 배양 접시 내의 오염된 섬유 조직에 갇혀 섬의 손실이 발생할 수 있으므로 이식 전에 집게를 사용하여 acinar 및 섬유질 조직을 포함하여 췌장에서 추가 섬 구성 요소를 직접 선택합니다(그림 1B). 해부 현미경으로. 따기 후 세포 여과기를 사용하여 단일 acinar 세포를 걸러냅니다.
3. 여과된 섬을 소 혈청 또는 알부민이 보충된 적절한 배양 배지 또는 완충 용액(예: 저혈당 DMEM, RPMI1640, CMRL1066 또는 HBSS)이 포함된 새 배양 접시로 옮겨 췌도가 플라스틱에 부착되는 것을 방지하고 접시를 소용돌이치게 하여 접시 중앙에 섬을 위치시킵니다(그림 1C). P200 마이크로피펫과 현미경을 사용하여 개별 섬을 적절한 수집 튜브에 넣습니다(그림 1D).
4. 50mL 플라스틱 튜브(그림 1E 왼쪽 및 중앙) 위에 새 40μm 세포 여과기를 놓고 새 배지로 필터를 세척합니다(그림 1E 오른쪽).
5. 1000μL 피펫을 사용하여 섬을 여과기에 추가하여 섬과 단일 acinar 세포를 분리합니다(그림 1 F1 및 그림 1F2).
   알림: 세포 여과기의 정제된 섬은 약 100% 순수합니다.
6. 집게를 사용하여 배양 배지가 들어 있는 새로운 60mm 또는 100mm 크기의 비처리 배양 접시 또는 소 혈청 또는 알부민이 보충된 적절한 완충 용액에 여과기를 뒤집습니다(그림 1 F3 및 그림 1F4). 신선한 배지/완충액을 사용하여 섬을 새로운 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 배양 접시에 총 부피가 약 20mL에 도달하도록 충분한 배지/완충액을 추가합니다.
7. 현미경으로 췌도를 세고 기증자 동물의 수에 따라 개별 1.5mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 췌도 수를 균등하게 나눕니다(그림 1G). 예를 들어, 두 마우스의 100-200 μm 췌도 당량 (IEQ) 200 개를 두 개의 튜브 각각에 추가합니다.
8. 실온에서 1분 이내에 2,100 x g에서 섬을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 약 20-30 μL의 잔류 용액이 일반적으로 튜브에 남아 있습니다 (그림 1H).

3. 부고환 지방 조직에 췌도 이식 및 부고환 백색 지방 조직으로 덮음

1. 수술 전에 작은 동물용 마취기, 실체 현미경, 광원, 200μL 마이크로피펫 팁이 있는 50-200μL 마이크로피펫, 면봉, 4-0 봉합 세트 및 소독된 수술 기구를 수집합니다(그림 2A). 쿠퍼 가위, 안과 용 가위, Pean 집게, 핀셋 및 바늘 홀더를 오토 클레이브하십시오. 오토클레이빙 후 장비를 1% 포비돈-요오드 용액에 담그십시오(그림 2A). 면봉을 사용하여 부고환 백색 지방 조직을 동원하고 출혈의 경우 지혈을 수행하십시오. 췌도 이식을 위해 50-200 μL 팁이있는 마이크로 피펫을 사용하십시오.
2. 흡입 마취제 (산소 중 2 % 이소 플루 란)를 사용하여 당뇨병 수용자 마우스에 마취를 전달하십시오. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 윤활제를 바르십시오. 그런 다음 마우스를 앙와위 자세(그림 2B 왼쪽)에 놓고 복부에서 털을 제거하여 이발기 및/또는 제모 크림을 사용하여 감염을 예방합니다. 포비돈-요오드 용액과 70 % 에탄올을 세 번 교대로 사용하여 복부와 사타구니 부위를 소독합니다 (그림 2B 오른쪽). 수술 전에 발가락 핀치 반사가 없어 마취 깊이를 확인하십시오. 가열 패드를 사용하여 수술 중 열 지원을 제공하고 수술용 드레이프를 사용하여 멸균 수술 부위를 고정합니다.
3. 낮은 중앙 영역에서 피부를 절개합니다 (그림 2C 왼쪽). 길이 약 2cm의 피부 절개를 권장합니다. Pean 집게로 왼쪽 복벽을 고정하고(무외상성 집게 또는 견인기도 사용할 수 있음) 조직을 마우스의 왼쪽으로 당겨 수술 부위를 고정합니다(그림 2C 오른쪽). 개복술 후 마취 유지를 위해 이소 플루 란의 비율을 1.0-1.5 %로 줄입니다.
4. 면봉을 사용하여 소장과 대장을 마우스의 오른쪽(즉, 작업자의 왼쪽)으로 움직입니다. 복강의 왼쪽 부고환 백색 지방 조직은 왼쪽 사타구니 부위에 위치합니다. 부고환 백색 지방 조직과 왼쪽 고환을 복부 바깥쪽으로 동원하고(그림 2D 왼쪽) 조직을 펴십시오(오른쪽 2D).
5. 200μL 피펫 팁이 장착된 P200 마이크로피펫을 사용하여 부드러운 피펫팅(그림 2E 왼쪽)으로 하나의 1.5mL 튜브에서 전체 췌도 부피를 수집하고, 수집 시 튜브에 췌도가 남지 않도록 주의합니다. 수집된 섬이 중력에 의해 피펫 끝에 가라앉도록 합니다(그림 2E 오른쪽).
6. 마이크로피펫 팁을 팽창된 지방 조직에 가볍게 놓습니다. 팁의 배지/완충액이 과도하게 플러싱되지 않도록 주의하면서 췌도를 조직에 조심스럽게 씨를 뿌립니다(그림 2F 왼쪽). 파종 후 해부 현미경으로 췌도의 올바른 위치를 확인하십시오 (그림 2F 오른쪽).
7. 부고환 백색 지방 조직으로 섬을 덮으십시오 (그림 2G). 봉합사 또는 생체 결합제의 사용은 필요하지 않습니다.
8. 왼쪽 고환을 부고환 백색 지방 조직 아래에 놓고 조직을 복강 내로 되돌립니다 (그림 2H). 4-0 봉합사를 사용하여 피부를 두 층(복막, 근육 및 피부)으로 닫습니다(나일론 또는 흡수성 봉합사와 같은 모든 봉합사를 사용할 수 있음)(그림 2I). 아세틸 살리실산 주입 (300 mg / kg; SQ) 수술 후 진통제를 위해 상처 근처. 그런 다음 마우스를 열 램프 아래에 놓고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오.

4. 췌도 이식 후 모니터링 (요약)

1. 수술 후 (POD) 28에서 혈당, 포도당 내성 검사 및 조직 학적 평가를 모니터링하여 췌도 이식의 치료 효과를 평가합니다.
   1. 작은 포도당 측정기를 사용하여 내당능 시험에서 혈당의 측정을 포함하여 혈당을 모니터링한다.
   2. 꼬리 정맥에서 혈액 샘플 (약간의 마이크로 리터)을 수집하십시오. 조직 학적 평가와 관련하여, 뮤린 인슐린 (이식 된 섬 검출 용) 및 폰 빌레 브란트 인자 (혈관 검출 용, 췌도 생착의 증거)는 면역 조직 화학에 의해 회수 된 부고환 지방 조직의 이식 된 섬에서 검출되었다.

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결과

지방으로 덮인 췌도 이식의 이식 효능을 복강 내 췌도 이식 후의 이식 효능과 비교하기 위해, 대조군 수용자 당뇨병 동물의 왼쪽 paracolic 공간에서 동일한 수의 췌도를 복막에 이식하였다. 지방으로 덮인 췌도 이식 마우스의 혈당 수치는 복강 내 췌도 이식 마우스에 비해 점진적으로 유의하게 감소하는 것으로 관찰되었다 (p = 0.0023; 그림 3A). 이식 1개월 후, 지방으로 덮인 췌도...

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토론

지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 췌도 이식과 지방 조직 내 췌도 이식의 두 가지 이식 기술의 기술을 통합합니다. 부고환 백색 지방 조직의 표면막은 복막에 의해 덮여 있고 부고환에 부착되어있는 백색 지방 조직으로 간주되기 때문에 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 해부학 적으로 복강 내 섬 이식의 일종으로 분류 할 수 있습니다. 그러나 췌도가 수용자에게 전달되는 기술은 지방 조직 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor