Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Riepilogo

Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l'uso di agenti bioleganti o sutura.

Abstract

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per il diabete mellito grave. La cavità intraperitoneale è tipicamente il sito di trapianto per questa procedura. Tuttavia, il trapianto di isole intraperitoneali presenta alcune limitazioni, tra cui la scarsa efficacia del trapianto, la difficile capacità di rilevamento dell'innesto e la mancanza di capacità di graftectomia per l'analisi post-trapianto. In questo articolo, "trapianto di isole ricoperte di grasso", un metodo di trapianto di isole intraperitoneali che utilizza tessuto adiposo bianco epididimale, viene utilizzato per valutare gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate. La semplicità del metodo sta nella semina di isole sul tessuto adiposo bianco dell'epididimo e nell'utilizzo del tessuto per coprire le isole. Mentre questo metodo può essere classificato come una tecnica di trapianto di isole intraperitoneali, condivide le caratteristiche con il trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Tuttavia, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso dimostra effetti terapeutici più robusti rispetto al trapianto di isole di tessuto intra-adiposo, compreso il miglioramento dei livelli di glucosio nel sangue e di insulina plasmatica e il potenziale di rimozione del trapianto. Si consiglia l'adozione di questo metodo per valutare i meccanismi di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco e gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.

Introduzione

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per i pazienti con diabete mellito grave. Recenti rapporti hanno dimostrato che i tassi di insulino-indipendenza a tre anni dal trapianto migliorano fino al 44%¹ e che circa l'80% dei riceventi che ricevono più di 600.000 equivalenti insulari totali raggiungono l'insulino-indipendenza². Inoltre, nel più recente rapporto del Collaborative Islet Transplant Registry, è stato rivelato che i livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati mantenuti a 60-140 mg / dL per un periodo di 5 anni in oltre il 70% dei pazienti sottoposti a trapianto di isole da solo. Lo studio ha anche determinato che circa il 90% dei pazienti che hanno ricevuto il trapianto di isole da solo o il trapianto di isole dopo trapianto di rene non hanno sviluppato eventi ipoglicemici gravi per oltre 5 anni³.

Sebbene i risultati clinici di questo trattamento siano migliorati, alcune limitazioni devono ancora essere affrontate, inclusa la necessità di stabilire un sito di trapianto ottimale. Il fegato è un tipico sito di trapianto per il trapianto di isole cliniche perché è l'organo più grande che può ospitare un elevato volume di isole. Tuttavia, in alcuni pazienti il fegato non è disponibile (ad esempio, a causa di ipertensione portale, epatite e / o cirrosi⁴) e quindi altri siti, tra cui lo spazio subcapsulare renale^5,6, la sacca omentale 7,8,9,10, il mesentere 11, il tratto gastrointestinale 12, il muscolo scheletrico 13, il tessuto sottocutaneo 13^, il midollo osseo¹⁴ e la milza ¹⁵ ,^16,17, sono stati considerati come siti di trapianto alternativi.

Sebbene il trapianto intraperitoneale di isole possa essere eseguito facilmente in anestesia locale, rendendo la cavità intraperitoneale un sito attraente per il trapianto clinico di isole, al momento del trapianto, le isole sono disperse in tutta la cavità intraperitoneale, rendendo difficile il rilevamento dell'attecchimento delle isole e la conferma dell'attecchimento di successo. Pertanto, la cavità intraperitoneale non è ampiamente riconosciuta come sito di trapianto clinico ideale. Invece, è spesso utilizzato come modello di controllo per studi preclinici per studiare l'efficacia delle isole trapiantate incapsulate¹⁸ e bioingegnerizzate¹⁹. Tuttavia, un confronto esatto tra isole bioingegnerizzate e di controllo è difficile da ottenere a causa delle difficoltà nell'eseguire una valutazione accurata dell'attecchimento.

Al contrario, l'uso di tessuto adiposo bianco intraperitoneale nella sacca omentale⁸, nel mesentere e in altre sedi extraepatiche è stato ben riportato 10,20,21,22,23 e molti degli studi che hanno studiato la funzione delle isole bioingegnerizzate trapiantate utilizzando tessuto adiposo bianco sono stati in grado di riportare risultati terapeutici promettenti^{20,24,25, 26}. Poiché l'uso del tessuto adiposo epididimo facilita la rilevazione delle isole trapiantate, il "metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso", utilizzando tessuto adiposo epididimale, è stato sviluppato per superare i limiti del trapianto di isole intraperitoneali. In questo articolo viene descritto il trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo epididimale.

Protocollo

La procedura seguente viene eseguita in tre passaggi. Il primo passo include l'induzione del diabete nei topi riceventi e l'isolamento delle isole donatrici. Il secondo passo prevede la preparazione delle isole prima del trapianto. Nella terza fase, viene eseguito il trapianto di isole sul tessuto adiposo epididimo e la copertura delle isole utilizzando il tessuto adiposo. Successivamente, sono stati valutati gli effetti terapeutici. La manipolazione dei topi e le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono conformi ai "Principi di cura degli animali da laboratorio" (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, National Institutes of Health pubblicazione 8^° edizione, 2011), e il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Fukuoka (numero di approvazione: 186018).

1. Preparazione chirurgica

1. Induzione del diabete: indurre il diabete in topi maschi riceventi di 20-25 g di peso corporeo, di 8-12 settimane attraverso iniezione endovenosa di 18 mg / ml di soluzione di streptozotocina preparata in tampone citrato 0,1 M (180 mg / kg di peso corporeo). I topi con livelli di glucosio nel sangue superiori a 400 mg / dL sono considerati diabetici. Utilizzare topi diabetici entro 1 settimana dopo l'induzione del diabete prima di un'eccessiva atrofia del tessuto adiposo bianco dell'epididimo per coprire le isole.
2. Isolamento delle isole: eseguire l'isolamento delle isole murine un giorno prima del trapianto seguendo il metodo²⁷ di Gotoh per l'isolamento delle isole.
3. In breve, digerire il tessuto pancreatico utilizzando la soluzione di collagenasi. Isolare le isole mediante centrifugazione a gradiente di densità utilizzando una soluzione appropriata di separazione cellulare. Quindi isole di coltura durante la notte in un incubatore a 22 ° C e 5% CO₂ (la coltura a <37 ° C è stata segnalata per prevenire la morte delle isole 28,29,30,31).
   NOTA: Manipolare le colture di isole purificate in un armadio di sicurezza. Filtrare-sterilizzare tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento e la coltura delle isole utilizzando un filtro da 0,22 μm.

2. Preparazione di isole per il trapianto

1. Raccogliere gli strumenti e i materiali appropriati come indicato nella Figura 1A.
2. Poiché gli enzimi digestivi come l'amilasi e la lipasi possono causare lesioni alle isole isolate e trapiantate e può verificarsi una perdita di isole intrappolate nella contaminazione dei tessuti fibrosi all'interno del piatto di coltura, prima del trapianto, utilizzare una pinza per selezionare manualmente qualsiasi componente extra-insulare dal pancreas, compresi i tessuti acinosi e fibrosi (Figura 1B), sotto un microscopio da dissezione. Dopo la raccolta, utilizzare un filtro cellulare per filtrare le singole cellule acinose.
3. Trasferire le isole filtrate in un nuovo piatto di coltura contenente qualsiasi terreno di coltura appropriato o soluzione tampone (ad esempio, DMEM con basso glucosio, RPMI1640, CMRL1066 o HBSS) integrato con siero bovino o albumina per evitare l'attaccamento delle isole alla plastica e ruotare il piatto per posizionare le isole al centro del piatto (Figura 1C). Utilizzando una micropipetta P200 e il microscopio, prelevare le singole isole in un tubo di raccolta appropriato (Figura 1D).
4. Posizionare un nuovo filtro cellulare da 40 μm sopra un tubo di plastica da 50 ml (Figura 1E a sinistra e al centro) e lavare il filtro con un mezzo fresco (Figura 1E a destra).
5. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per aggiungere le isole al filtro per separare le isole e le singole celle acinose (Figura 1 F1 e Figura 1F2).
   NOTA: Le isole purificate sul filtro cellulare saranno pure al 100%.
6. Utilizzare una pinza per capovolgere il filtro su un nuovo piatto di coltura non trattato di dimensioni 60 o 100 mm contenente terreno di coltura o una soluzione tampone appropriata integrata con siero bovino o albumina (figura 1 F3 e figura 1F4). Utilizzare un mezzo / tampone fresco per lavare le isole in un nuovo piatto di coltura. Quindi aggiungere un mezzo / tampone sufficiente al piatto di coltura per raggiungere un volume totale di circa 20 ml.
7. Contare le isole al microscopio e dividere equamente il numero di isole tra le singole provette di centrifuga in plastica da 1,5 mL in base al numero di animali donatori (Figura 1G). Ad esempio, duecento, 100-200 μm di isolotti equivalenti (IEQ) da due topi verrebbero aggiunti a ciascuno dei due tubi.
8. Centrifugare le isole a 2.100 x g entro 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Circa 20-30 μL di soluzione residua rimarranno tipicamente nel tubo (Figura 1H).

3. Trapianto di isole su tessuto adiposo epididimo e copertura con tessuto adiposo bianco epididimo

1. Prima dell'intervento, raccogliere una macchina per anestesia per piccoli animali, stereomicroscopio, sorgente luminosa, micropipetta da 50-200 μL con punte per micropipette da 200 μL, tamponi di cotone, un set di sutura 4-0 e strumenti chirurgici disinfettati (Figura 2A). Autoclave le forbici da bottaio, le forbici oftalmiche, le pinze per piselli, le pinzette e i portaaghi. Dopo l'autoclave, immergere l'apparecchiatura in una soluzione di iodio povidone all'1% (Figura 2A). Utilizzare tamponi di cotone per la mobilizzazione del tessuto adiposo bianco epididimo e per l'emostasi in caso di sanguinamento. Utilizzare una micropipetta con punte da 50-200 μL per il trapianto di isole.
2. Somministrare l'anestesia al topo ricevente diabetico utilizzando un agente anestetico inalato (isoflurano al 2% in ossigeno). Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione. Quindi posizionare il mouse in posizione supina (Figura 2B a sinistra) e rimuovere i peli dall'addome per prevenire l'infezione utilizzando tagliacapelli e / o crema depilatoria. Disinfettare l'addome e la regione inguinale utilizzando almeno tre cicli alternati di una soluzione di povidone-iodio seguiti da etanolo al 70% (Figura 2B a destra). Prima dell'intervento, confermare la profondità dell'anestesia attraverso l'assenza di un riflesso del pizzico del piede. Fornire supporto termico intraoperatorio utilizzando una piastra riscaldante e utilizzare un drappo chirurgico per fissare l'area chirurgica sterile.
3. Incidere la pelle nella zona mediana inferiore (Figura 2C a sinistra). Si raccomanda un'incisione cutanea di circa 2 cm di lunghezza. Bloccare la parete addominale sinistra con la pinza Pean (è possibile utilizzare anche una pinza atraumatica o un divaricatore) e tirare il tessuto sul lato sinistro del mouse per fissare il campo chirurgico (Figura 2C a destra). Dopo laparotomia, diminuire la percentuale di isoflurano all'1,0-1,5% per il mantenimento dell'anestesia.
4. Utilizzare un batuffolo di cotone per mobilitare l'intestino tenue e crasso sul lato destro del mouse (cioè sul lato sinistro dell'operatore). Il tessuto adiposo bianco epididimo sinistro nella cavità addominale si trova nella zona inguinale sinistra. Mobilitare il tessuto adiposo bianco epididimo e il testicolo sinistro all'esterno dell'addome (Figura 2D a sinistra) e allungare il tessuto (2D a destra).
5. Utilizzare una micropipetta P200 dotata di una punta di pipetta da 200 μL per raccogliere l'intero volume di isole da un tubo da 1,5 mL con un pipettaggio delicato (Figura 2E a sinistra), avendo cura che non rimangano isole nel tubo al momento della raccolta. Lasciare che le isole raccolte si depositino sulla punta della pipetta per gravità (Figura 2E a destra).
6. Posizionare leggermente la punta della micropipetta sul tessuto adiposo disteso. Avendo cura di evitare un eccessivo lavaggio del substrato / tampone nella punta, seminare accuratamente le isole sul tessuto (Figura 2F a sinistra). Dopo la semina, confermare un corretto posizionamento delle isole al microscopio da dissezione (Figura 2F a destra).
7. Coprire le isole con il tessuto adiposo bianco epididimo (Figura 2G). Non è necessario l'uso di punti di sutura o agenti bioleganti.
8. Posizionare il testicolo sinistro sotto il tessuto adiposo bianco dell'epididimo e riportare i tessuti nella cavità intraperitoneale (Figura 2H). Chiudere la pelle in due strati (peritoneo, poi muscolo e pelle) utilizzando una sutura 4-0 (è possibile utilizzare qualsiasi sutura come nylon o suture assorbibili) (Figura 2I). Iniettare acido acetilsalicilico (300 mg/kg; SQ) vicino alla ferita per analgesia postoperatoria. Quindi posizionare il mouse sotto una lampada di calore e monitorare fino al completo recupero.

4. Monitoraggio dopo trapianto di isole (Riassunto)

1. Valutare gli effetti terapeutici del trapianto di isole monitorando la glicemia, il test di tolleranza al glucosio e la valutazione istologica al giorno postoperatorio (POD) 28.
   1. Monitorare la glicemia, comprese le misurazioni della glicemia al test di tolleranza al glucosio, utilizzando un piccolo misuratore di glucosio.
   2. Raccogliere i campioni di sangue (un po 'di microlitri) dalla vena della coda. Per quanto riguarda la valutazione istologica, l'insulina murina (per rilevare le isole innestate) e il fattore di von Willebrand (per il rilevamento dei vasi, che è una prova per l'attecchimento delle isole) sono stati rilevati nelle isole trapiantate nel tessuto adiposo epididimo recuperato mediante immunoistochimica.

Risultati

Per confrontare l'efficacia del trapianto di isole ricoperte di grasso con quella dopo il trapianto di isole intraperitoneali, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali (p = 0,0023; Figura 3A)...

Discussione

Il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso incorpora tecniche di due diverse tecniche di trapianto: trapianto di isole intraperitoneali e trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Poiché la membrana superficiale del tessuto adiposo bianco dell'epididimo è considerata il tessuto adiposo bianco coperto dal peritoneo e che è attaccato all'epididimo, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso può essere anatomicamente classificato come un tipo di trapianto di isole intraperitoneali. La tecnica con cu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor