使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像

摘要

在这里，我们提出了一种通过延时共聚焦显微镜研究产后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种使用重组腺相关病毒载体（以 Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白）对视网膜细胞类型及其精细过程进行稀疏标记和获取的方法。

摘要

发现树突状乔木的模式需要方法在发育过程中可视化，成像和分析树突。小鼠视网膜是一个强大的模型系统，用于研究神经元形态发生和连接的细胞类型特异性机制。视网膜亚型的组织和组成是明确的，遗传工具可用于在发育过程中访问特定类型。许多视网膜细胞类型也将其树突和/或轴突限制在狭窄的层，这有助于延时成像。小鼠视网膜外植体培养物非常适合使用共聚焦或多光子显微镜进行活细胞成像，但缺乏针对具有时间和结构分辨率的树突动力学成像优化的方法。这里介绍的是一种稀疏地标记和成像由Cre-Lox系统标记的特定视网膜群体发展的方法。这里使用的市售腺相关病毒（AAV）以Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白。新生儿小鼠中AAV的眼内递送在注射后4-5天（dpi）产生靶向细胞类型的荧光标记。膜荧光信号可通过共聚焦成像进行检测，并解析精细的分支结构和动力学。从充满含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平片成像仪获取跨越2-4小时的高质量视频。还提供了用于反卷积和三维（3D）漂移校正的图像后处理管道。该协议可用于捕获完整视网膜中的几种细胞行为，并确定控制神经突起形态的新因素。在视网膜中学到的许多发育策略将与理解中枢神经系统其他地方的神经回路的形成有关。

引言

视网膜神经元的树突形成复杂但特定的模式，影响它们在神经回路中的功能。在脊椎动物视网膜中，不同类型的视网膜神经节细胞（RGC）和柏宁细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突形态在心轴大小、位置、分支长度和密度上有所不同¹。在产后发育过程中，RGC和amcrine细胞将旺盛的树突突延伸到称为内丛状层（IPL）的神经瞳孔中，在那里它们接收双极细胞输入，发送光感受器信号²。通过对雏鸡或斑马鱼幼虫中荧光标记的视网膜种群进行延时成像捕获，树突形态发生具有高度动态^性3，4，5。在几天内，树突状乔木膨胀，重塑并撞击到IPL的狭窄子层，在那里它们与选定的伙伴突触。乔木在发育过程中表现出不同的结构动力学，分支增加，收缩和稳定的相对速率发生变化。Amacrine和RGC枝晶也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了特定类型的树木化。然而，这些研究追踪了广泛的amcrine或RGC群体，并专注于层流靶向，这只是形态学的一个方面。

产生在视网膜亚型中观察到的巨大形态多样性的机制知之甚少。该小组的目标是开发一种方法来捕获小鼠中定义的视网膜亚型的树突动力学和乔木重塑。识别树突图案化的细胞类型特异性机制需要可视化和测量目标细胞的....

研究方案

注意：该方案跨越2天，实验日之间的病毒转导最短时间为4-5天（图1A）。动物实验是根据加拿大动物护理委员会根据病童医院动物服务实验室动物使用和护理委员会批准的协议进行的，用于研究和实验动物护理。

1. 新生儿AAV注射和成像实验的准备

1. 选择Cre小鼠线以标记感兴趣的视网膜细胞群。在AAV注射时，通过与Cre转基因报告基因交叉或通过Cre抗体免疫染色来确认Cre重组酶的表达。
2. 繁殖转基因Cre小鼠（8-16周龄）以产生Cre阳性的新生动物。
   注意：对于此演示，ChAT-IRES-Cre敲入小鼠用于靶向胆碱能星爆amacrine细胞。
3. 获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记，请选择表达靶向质膜的修饰XFP的载体。
   注意：本研究使用了Brainbow病毒（BBV），AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT（见材料表），它们提供了多色标记的选择（图1B）。法呢基化的增强型黄色荧光蛋白（eYFP）和单体樱桃（mCherry）表达为实时成像产生了最强的荧光信号。单个BBV可用于对单个心轴进行成像，而BBV的共同注射可用于标记具有不同荧光团的更多细胞或相邻心轴。如果使用多种荧光蛋白，请确保最小的发射光谱重叠（

结果

使用上述协议，采集了星爆细胞枝晶发育的高分辨率3D视频，对其进行了解卷积，并针对3D漂移进行了校正。生成Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频（补充视频1， 图5A）。每个时间点的3D反卷积提高了细丝状突起的分辨率（图5B，C）。细丝状突起是视网膜树突发育的特征³⁶ ，在影像学检查过程中应可见。AA.......

讨论

该视频演示了一个实验管道，该管道利用现有的遗传工具，通过共聚焦实时成像对发育中的视网膜神经元的树突动力学进行成像。还证明了将编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖性AAVs的眼内注射到新生小鼠中。遗传靶向群体的单细胞早在4-5 dpi时就被明确标记。为标准成像室准备视网膜平片支架以执行活细胞共聚焦成像。这种方法可以生成单个细胞及其精细投影的高分辨率延时视频。使用开源软件（包?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper	Whatman	1001-070
Dumont #5 fine forceps	FST	11252-20	Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps	VWR	82027-426
Fine Scissors	FST	14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size	Millipore	HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm	VWR	470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette	VWR	470225-034
Round tip paint brush, size 3/0	Conventional art supply store		Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors	FST	14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	FST	15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10'	Warner Instruments	64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective	Leica	15506374
Heater controller cable	Warner Instruments	CC-28
Large bath incubation chamber with slice support	Warner Instruments	RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)	Warner Instruments	PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	55-4148
Sample anchor (Harps)	Warner Instruments	64-0260	Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater	Warner Instruments	SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle	Hamilton Company	80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)	BD PrecisionGlide	305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vector Core	AV-9-PV2453	Addgene Plasmid #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Green tattoo paste	Ketchum MFG Co	329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102	Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test strips (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Open source