需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里,我们提出了一种通过延时共聚焦显微镜研究产后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种使用重组腺相关病毒载体(以 Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白)对视网膜细胞类型及其精细过程进行稀疏标记和获取的方法。

摘要

发现树突状乔木的模式需要方法在发育过程中可视化,成像和分析树突。小鼠视网膜是一个强大的模型系统,用于研究神经元形态发生和连接的细胞类型特异性机制。视网膜亚型的组织和组成是明确的,遗传工具可用于在发育过程中访问特定类型。许多视网膜细胞类型也将其树突和/或轴突限制在狭窄的层,这有助于延时成像。小鼠视网膜外植体培养物非常适合使用共聚焦或多光子显微镜进行活细胞成像,但缺乏针对具有时间和结构分辨率的树突动力学成像优化的方法。这里介绍的是一种稀疏地标记和成像由Cre-Lox系统标记的特定视网膜群体发展的方法。这里使用的市售腺相关病毒(AAV)以Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白。新生儿小鼠中AAV的眼内递送在注射后4-5天(dpi)产生靶向细胞类型的荧光标记。膜荧光信号可通过共聚焦成像进行检测,并解析精细的分支结构和动力学。从充满含氧人工脑脊液(aCSF)的视网膜平片成像仪获取跨越2-4小时的高质量视频。还提供了用于反卷积和三维(3D)漂移校正的图像后处理管道。该协议可用于捕获完整视网膜中的几种细胞行为,并确定控制神经突起形态的新因素。在视网膜中学到的许多发育策略将与理解中枢神经系统其他地方的神经回路的形成有关。

引言

视网膜神经元的树突形成复杂但特定的模式,影响它们在神经回路中的功能。在脊椎动物视网膜中,不同类型的视网膜神经节细胞(RGC)和柏宁细胞中间神经元具有独特的树突形态,其树突形态在心轴大小、位置、分支长度和密度上有所不同1。在产后发育过程中,RGC和amcrine细胞将旺盛的树突突延伸到称为内丛状层(IPL)的神经瞳孔中,在那里它们接收双极细胞输入,发送光感受器信号2。通过对雏鸡或斑马鱼幼虫中荧光标记的视网膜种群进行延时成像捕获,树突形态发生具有高度动态性345。在几天内,树突状乔木膨胀,重塑并撞击到IPL的狭窄子层,在那里它们与选定的伙伴突触。乔木在发育过程中表现出不同的结构动力学,分支增加,收缩和稳定的相对速率发生变化。Amacrine和RGC枝晶也表现出不同的生长和重塑行为,这可能反映了特定类型的树木化。然而,这些研究追踪了广泛的amcrine或RGC群体,并专注于层流靶向,这只是形态学的一个方面。

产生在视网膜亚型中观察到的巨大形态多样性的机制知之甚少。该小组的目标是开发一种方法来捕获小鼠中定义的视网膜亚型的树突动力学和乔木重塑。识别树突图案化的细胞类型特异性机制需要可视化和测量目标细胞的....

研究方案

注意:该方案跨越2天,实验日之间的病毒转导最短时间为4-5天(图1A)。动物实验是根据加拿大动物护理委员会根据病童医院动物服务实验室动物使用和护理委员会批准的协议进行的,用于研究和实验动物护理。

1. 新生儿AAV注射和成像实验的准备

  1. 选择Cre小鼠线以标记感兴趣的视网膜细胞群。在AAV注射时,通过与Cre转基因报告基因交叉或通过Cre抗体免疫染色来确认Cre重组酶的表达。
  2. 繁殖转基因Cre小鼠(8-16周龄)以产生Cre阳性的新生动物。
    注意:对于此演示,ChAT-IRES-Cre敲入小鼠用于靶向胆碱能星爆amacrine细胞。
  3. 获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记,请选择表达靶向质膜的修饰XFP的载体。
    注意:本研究使用了Brainbow病毒(BBV),AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT(见材料表),它们提供了多色标记的选择(图1B)。法呢基化的增强型黄色荧光蛋白(eYFP)和单体樱桃(mCherry)表达为实时成像产生了最强的荧光信号。单个BBV可用于对单个心轴进行成像,而BBV的共同注射可用于标记具有不同荧光团的更多细胞或相邻心轴。如果使用多种荧光蛋白,请确保最小的发射光谱重叠(

结果

使用上述协议,采集了星爆细胞枝晶发育的高分辨率3D视频,对其进行了解卷积,并针对3D漂移进行了校正。生成Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频(补充视频1图5A)。每个时间点的3D反卷积提高了细丝状突起的分辨率(图5B,C)。细丝状突起是视网膜树突发育的特征36 ,在影像学检查过程中应可见。AA.......

讨论

该视频演示了一个实验管道,该管道利用现有的遗传工具,通过共聚焦实时成像对发育中的视网膜神经元的树突动力学进行成像。还证明了将编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖性AAVs的眼内注射到新生小鼠中。遗传靶向群体的单细胞早在4-5 dpi时就被明确标记。为标准成像室准备视网膜平片支架以执行活细胞共聚焦成像。这种方法可以生成单个细胞及其精细投影的高分辨率延时视频。使用开源软件(包?.......

披露声明

作者没有任何内容可披露。

致谢

我们感谢麦迪逊·格雷(Madison Gray)在我没有帮助的时候帮了我一把。这项研究得到了NSERC发现补助金(RGPIN-2016-06128),斯隆神经科学奖学金和加拿大研究主席Tier 2(J.L.L)的支持。S. Ing-Esteves得到了视觉科学研究计划和NSERC研究生奖学金博士的支持。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paperWhatman1001-070
Dumont #5 fine forcepsFST11252-20Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forcepsVWR82027-426
Fine ScissorsFST14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore sizeMilliporeHABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mmVWR470313-352
Polyethylene disposable transfer pipetteVWR470225-034
Round tip paint brush, size 3/0Conventional art supply storeTwo size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical ScissorsFST14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting EdgeFST15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10'Warner Instruments64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objectiveLeica15506374
Heater controller cableWarner InstrumentsCC-28
Large bath incubation chamber with slice supportWarner InstrumentsRC-27L
MPII Mini-Peristaltic PumpHarvard Apparatus70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)Warner InstrumentsPM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic PumpHarvard Apparatus55-4148
Sample anchor (Harps)Warner Instruments64-0260Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution HeaterWarner InstrumentsSF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable NeedleHamilton Company80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)BD PrecisionGlide305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])Sigma-AldrichV001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYFPenn Vector CoreAV-9-PV2453Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF
Penn Vector CoreAV-9-PV2454Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse lineThe Jackson Laboratory6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 %Sigma-AldrichF7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Green tattoo pasteKetchum MFG Co329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigma-Aldrich806552
Pneumatic PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)AirGasX02OX95C2003102Supplier may vary depending on region
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPES, Free AcidBio BasicHB0264
Hydrochloric acid solution, 1 NSigma-AldrichH9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)Sigma-AldrichM2670
pH-Test strips (6.0-7.7)VWRBDH35317.604
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541
Sodium chloride (NaCl)Bio BasicDB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJNational Institutes of Health (NIH)Open source

参考文献

  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specifi....

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

169 Cre Lox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

科研

教育

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。