Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von Mechanismen, die dendritische Dornen strukturieren, erfordert Methoden zur Visualisierung, Abbildung und Analyse von Dendriten während der Entwicklung. Die Mausnetzhaut ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung zelltypspezifischer Mechanismen der neuronalen Morphogenese und Konnektivität. Die Organisation und Zusammensetzung der retinalen Subtypen ist klar definiert, und genetische Werkzeuge stehen zur Verfügung, um während der Entwicklung auf bestimmte Typen zuzugreifen. Viele retinale Zelltypen beschränken ihre Dendriten und / oder Axone auch auf schmale Schichten, was die Zeitrafferbildgebung erleichtert. Maus-Retina-Explantationskulturen eignen sich gut für die Lebendzellbildgebung mittels konfokaler oder Multiphotonenmikroskopie, aber es fehlen Methoden, die für die Bildgebung der Dendritendynamik mit zeitlicher und struktureller Auflösung optimiert sind. Hier wird eine Methode vorgestellt, um die Entwicklung spezifischer Netzhautpopulationen, die durch das Cre-Lox-System gekennzeichnet sind, spärlich zu markieren und abzubilden. Kommerziell erhältliche Adeno-assoziierte Viren (AAVs), die hier verwendet werden, exprimierten membranzielgerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise. Die intraokulare Verabreichung von AAVs bei neonatalen Mäusen führt zu einer fluoreszierenden Markierung der Zielzelltypen durch 4-5 Tage nach der Injektion (dpi). Die Membranfluoreszenzsignale sind durch konfokale Bildgebung detektierbar und lösen feine Aststrukturen und -dynamiken auf. Hochwertige Videos von 2-4 h werden von bildgebenden retinalen Flatmounts aufgenommen, die mit sauerstoffreicher künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) durchblutet sind. Ebenfalls enthalten ist eine Bildnachbearbeitungspipeline zur Dekonvolution und dreidimensionalen (3D) Driftkorrektur. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere zelluläre Verhaltensweisen in der intakten Netzhaut zu erfassen und neue Faktoren zu identifizieren, die die Morphogenese der Neuriten steuern. Viele Entwicklungsstrategien, die in der Netzhaut erlernt werden, werden für das Verständnis der Bildung neuronaler Schaltkreise an anderer Stelle im zentralen Nervensystem relevant sein.

Einleitung

Dendriten von Netzhautneuronen bilden komplizierte, aber spezifische Muster, die ihre Funktion innerhalb neuronaler Schaltkreise beeinflussen. In der Netzhaut von Wirbeltieren tragen verschiedene Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs) und Amacrinzell-Interneuronen einzigartige dendritische Morphologien, die sich in Baumgröße, Lage, Astlänge und Dichte ^{unterscheiden1.} Während der postnatalen Entwicklung verlängern RGCs und Amacrinzellen überschwängliche dendritische Prozesse in einen Neuropil, der als innere plexiforme Schicht (IPL) bezeichnet wird, wo sie bipolare Zelleingänge empfangen, die Photorezeptorsignale ^{übertragen2....}

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll erstreckt sich über 2 Tage mit einem Mindestzeitraum von 4-5 Tagen für die Virustransduktion zwischen den Versuchstagen (Abbildung 1A). Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für die Verwendung von Tieren in der Forschung und Labortierpflege gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) genehmigt wurden.

1. Vorbereitungen für die neugeborenen AAV-Injektionen und bildgebenden Versuche

1. Wählen Sie eine Cre-Mauslinie aus, um....

Ergebnisse

Mit dem obigen Protokoll wurde ein hochauflösendes 3D-Video der Entwicklung von Starburst-Zelldendriten aufgenommen, dekonvolviert und für die 3D-Drift korrigiert. Es wurden maximale Projektionen der Z-Ebene erstellt, um 2D-Videos für die Analyse zu erstellen (Ergänzendes Video 1, Abbildung 5A). Die 3D-Dekonvolution jedes Zeitpunkts erhöhte die Auflösung von feinen Filopodienprojektionen (Abbildung 5B,C). Feine Filopodienv.......

Diskussion

Dieses Video zeigt eine experimentelle Pipeline, die vorhandene genetische Werkzeuge nutzt, um die Dendritendynamik der sich entwickelnden Netzhautneuronen mit konfokaler Live-Bildgebung abzubilden. Gezeigt werden auch intraokulare Injektionen von Cre-abhängigen AAVs, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in neonatale Mäuse kodieren. Einzelzellen genetisch zielgerichteter Populationen sind bereits mit 4-5 dpi hell markiert. Retinale flache Montierungen wurden für Standard-Bildgebungskammern vorbereitet, um ko.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper	Whatman	1001-070
Dumont #5 fine forceps	FST	11252-20	Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps	VWR	82027-426
Fine Scissors	FST	14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size	Millipore	HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm	VWR	470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette	VWR	470225-034
Round tip paint brush, size 3/0	Conventional art supply store		Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors	FST	14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	FST	15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10'	Warner Instruments	64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective	Leica	15506374
Heater controller cable	Warner Instruments	CC-28
Large bath incubation chamber with slice support	Warner Instruments	RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)	Warner Instruments	PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	55-4148
Sample anchor (Harps)	Warner Instruments	64-0260	Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater	Warner Instruments	SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle	Hamilton Company	80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)	BD PrecisionGlide	305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vector Core	AV-9-PV2453	Addgene Plasmid #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Green tattoo paste	Ketchum MFG Co	329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102	Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test strips (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Open source