用利甘德分析（DRACALA）的微分径向毛细管作用识别小配体的结合蛋白

摘要

利甘德分析（DRaCALA）的微分径向毛细管作用可用于使用ORFeome库识别生物体的小配体结合蛋白。

摘要

在过去的十年里，细菌生理学中对小信号分子的理解取得了巨大的进步。特别是，在模型生物体中系统地识别和研究了几个核苷酸衍生的二次信使（NSM）的目标蛋白质。这些成就主要归功于一些新技术的发展，包括捕获复合技术和配体检测（DRaCALA）的微分径向毛细管作用，这些技术被用来系统地识别这些小分子的目标蛋白质。本文描述了使用NSM，瓜诺辛五角星和四磷酸盐（p）pppGpp，作为DRACALA技术的例子和视频演示。使用DRaCALA，在模型有机体 Escherichia大肠杆菌 K-12中发现了20种已知蛋白质中的9种，以及12种新靶蛋白（p）pppGpp，显示了这种测定的力量。原则上，DRACALA可用于研究可标有放射性同位素或荧光染料的小配体。这里讨论了 DRACALA 的关键步骤、优点和缺点，以便进一步应用此技术。

引言

细菌使用几个小信号分子来适应不断变化的环境^1，2。例如，自动诱导剂，N-乙酰异丙胺乳酮及其改良的寡肽，调解细胞间细菌之间的交流，以协调人群行为，这种现象被称为法定人数感应^2。另一组小信号分子是NSM，包括广泛研究的环状腺苷单磷酸盐（cAMP）、环二聚氨酸、环状二磷酸盐（环二磷酸盐）和瓜诺辛五磷酸盐和四磷酸盐（p）pppGpp^1。细菌产生这些NSM作为对各种不同压力条件的反应。一旦产生，这些分子结合到他们的目标蛋白质，并调节几个不同的生理和代谢途径，以应付遇到的压力，提高细菌的生存能力。因此，识别目标蛋白是破译这些小分子分子功能的必然前提。

在过去的十年里，对这些小信号分子的了解激增，这主要是因为一些技术创新揭示了这些小分子的目标蛋白质。其中包括捕获复合技术^3，4，5，和配体检测（DRaCALA）6的微分径向毛细管作用，本文将讨论。

DRaCALA 由文森特·李和同事于 2011^{年 6 月}发明，它部署了硝基纤维素膜的能力，以微分隔离无蛋白质和蛋白质结合的配体。蛋白质等分子不能扩散到亚硝基纤维素膜上，而小配体（如NSM）能够扩散。通过将NSM（例如ppGpp）与要测试的蛋白质混合，并在膜上发现它们，可以预期两种情况（图1）:如果（p）ppppp与蛋白质结合，放射性标签（p）pppGpp将由蛋白质保留在点的中心，并且不会向外扩散，从而给出一个强烈的小点（即， 强烈的放射性信号）在磷构体下。然而，如果（p）pppGpp不与蛋白质结合，它将自由向外扩散，产生一个具有均匀背景放射性信号的大点。

此外，如果蛋白质存在足够的量，DRACALA可以检测小分子和整个细胞解剖中未纯化蛋白质之间的相互作用。这种简单性允许使用 DRACALA 使用 ORFeome 表达库快速识别蛋白质靶点。事实上，使用 DRaCALA 系统地识别了 cAMP^7、环形二安培^8、环形二聚氰化物^9、10和 （p） pppGpp 11、12、13 的目标蛋白质。本视频文章以 （p） ppGpp 为例，演示和描述成功进行 DRACALA 筛查的关键步骤和考虑因素。值得注意的是，强烈建议在执行 DRACALA 之前，结合本文阅读对 DRACALA¹⁴进行更详尽的描述。

图1:德拉卡拉（A）示意图分析原理。有关详细信息，请参阅文本。（B） 约束分数的量化和计算。有关详细信息，请参阅文本。简言之，DRaCALA 点将通过绘制两个圆圈来分析，这些圆圈将整个点和内部暗点（即由于测试蛋白质的结合而保留的 （p）pPpGpp）。特定的结合信号是减去非特定背景信号（按_A1×计算（S 2-S 1）/（A_2-A1）后内圈_（S1）的放射性信号。结合分数是除以总放射性信号 （S2） 的特定绑定信号。缩写: Dracala = 利甘德分析的差速径向毛细管操作;（p） ppgpp = 瓜诺辛五角星和四磷酸盐;RT = 室温。请单击此处查看此图的较大版本。

研究方案

1. 准备整个细胞解解剂

1. 接种 大肠杆菌 K-12 ASKA ORFeome系列菌株¹⁵ 到1.5mL莱索根肉汤（LB），含有25微克/mL氯霉素在96井深井板。在 30 °C 下生长 18 小时（O/N），在 160 rpm 时摇晃。第二天，在O/N培养物中加入异丙基β-d-1-硫高拉托平旁（IPTG）（最终0.5mM），以在30°C为6h时诱导蛋白质表达。
2. 颗粒细胞在 500 x g 为 10 分钟。将颗粒冻结在 -80 °C 下，直到使用。要解冻细胞，请添加 150 μL 裂解缓冲 L1 （40 mM Tris pH 7.5， 100 m M NaCl， 10 m MgCl₂， 辅以 2m 苯甲基磺胺 （PMSF）， 40 μg/mL DNase 1， 和 0.5 毫克/mL 溶酶） 以重新悬浮颗粒。
3. 将细胞冻结在 -80 °C 下 30 分钟，然后在 37 °C 下解冻 20 分钟。重复此循环三次以解合细胞。使用前将解剖物存储在 -80 °C。

2. 净化雷尔_塞克 和格帕

注:来自链球菌等价物的重组蛋白Rel_seq和来自大肠杆菌K-12的GppA分别用于合成放射性标签pppGpp和ppGpp。

1. 生长和收集细胞过度表达每种蛋白质。
   1. 将大肠杆菌BL21 DE3 菌株种植到 LB 汤中的指数相（光学密度 （OD） +0.3-0.4），并在 6000 x g下旋转 1 mL 培养体，持续 5 分钟。将超高肉汤除以，并重新使用 100 μL 冰冷 TSB 汤（LB 汤辅以 0.1 克/mL PEG3350、0.05 mL/mL 二甲基硫化物、20 m M MgCl_2）。
   2. 将带有组织丁标签的乳腺和gppA混合，每粒 100 ng，在 TSB 中加入上述细胞悬浮物，并在冰上孵育 30 分钟。热冲击细胞在42°C为40s。将混合物放在冰上2分钟，并在室温下加入1mL的LB肉汤，使细胞在37°C时恢复1小时，在160转时搅拌。
   3. 将回收的细胞镀在 LB Agar 板上，辅以相应的抗生素（Rel_seq:100 μg/mL 安皮西林;GppA: 30 微克/mL 卡纳霉素）。第二天，在LB肉汤中给菌落接种疫苗，在37°C下开始两种菌株的O/N预栽培。
   4. 18小时后，接种500 mL的LB介质，10 mL的O/N培养物和相应的抗生素。在 37 °C 下以 160 rpm 的速度摇晃来培养文化。 当OD_600nm 达到 0.5-0.7 时，通过添加 0.5 mM IPTG 来诱导蛋白质表达，并在 30 °C 下生长 3 小时，在 160 rpm 时摇晃。
   5. 在 4 °C 下以 6084 x g 旋转 10 分钟来收集细胞。 将颗粒重新沉积在 20 mL 的冰冷 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在 1912 x g 下以 1912 x g 在 4 °C 下重新离心机 20 分钟。 将超高颗粒除以-20°C，然后再使用。
2. 镍-氮酸（尼-NTA）亲和纯化
   注意:从此以后，请确保样品是冷的。
   1. 加入40mL的冰冷裂解缓冲L2（50mM Tris pH 7.5，150mM NaCl，5%甘油，10mM imidazole，10mM β-甲醇补充蛋白酶抑制剂（EDTA无片剂:见 材料表）来重新使用颗粒。通过声波（60% 振幅，2 s On/4 s 关闭 8 分钟开）来解振细胞。在 4°C 下以 23，426 x g 旋转 40 分钟，清除解糖，并继续用超高分子进行净化。
   2. 在上述离心过程中，准备尼-NTA树脂。
      1. 将 500 μL 的同质化 Ni-NTA 树脂转移到站立的聚丙烯色谱柱中，让它沉淀 15 分钟，存储溶液排出。用 15 mL 超纯水清洗树脂两次，然后用 15 mL 的裂解缓冲器 L2 清洗柱子。
   3. 将清除的细胞解解剂从第 1 步加载到柱子上，然后让它流过。用 30 mL 的洗涤缓冲器（50 m Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% 甘油、20 mM imidazole）清洗柱子。
   4. 用 400 μL 的洗发缓冲器 （50 mM Tris pH 7.5， 150 mM NaCl， 5% 甘油， 500 mM imidazole） 三次来吸收蛋白质。然后，用另外 300 μL的放射缓冲器重复。将精化蛋白组合到最终体积为 700 μL。
3. 凝胶过滤
   1. 准备凝胶过滤缓冲器（50 mM Tris，pH 7.5;200mM NaCl;5%甘油）。用凝胶过滤缓冲器的一列体积（25 mL）清洗尺寸排除列。
   2. 使用 500 μL 循环加载上述 700 μL 样品，以 0.5 mL/min 的速度运行，并收集包含相应蛋白质的 0.5 mL 体积的 2-3 个分数。
   3. 使用自旋柱组合和浓缩包含每个蛋白质的分数，并使用布拉德福德检测测量蛋白质浓度。

3. 合成 ³²个 P 标记的 pppgpp 和 ppgpp

1. 在螺丝帽管中组装小规模的 Rel_seq反应（参见表 1）。
   注:仅在有执照的地方使用放射性试剂和个人防护设备。

	卷 （μL）
	小规模	大型
超纯水
10 倍雷尔塞克 缓冲*	2	50
ATP （8 mM 决赛）
雷尔塞克 （4 μM 决赛）
32P-α-瓜诺辛三磷酸盐（GTP）（最终120纳米）（警告）	0.2	5
总	20	500

表1:汇总³²个P标签ppgpp的小型和大规模合成反应信息。 *10倍Relseq缓冲器包含250mTris-HCl，pH 8.6:1M 纳克;80m M MgCl₂。缩写: pppgpp = 瓜诺辛五磷酸盐。

2. 在 37 °C 的热混合器中孵育管子 1 小时，然后在 95 °C 处孵化 5 分钟，并在冰上放置 5 分钟。将沉淀蛋白以 15，700 x g 旋转 5 分钟，并将超高纳特（合成 ³²P-pppGpp）转移到新的螺丝帽管中。
3. 要从 ³²Ppppp 中合成 ³²PppGpp，将 ³²pppGpp 产品的一半转移到新的螺丝帽管中，并添加 1 μM Gppa。在 37 °C 处孵育管子 10 分钟，在 95 °C 处孵化 5 分钟，然后在冰上放置 5 分钟。
4. 将沉淀蛋白以 15，700 x g 旋转 5 分钟，并将超高纳特（合成 ³²P-ppGpp）转移到新的螺丝帽管中。
5. 使用^{1.5 M KH 2}PO_4、pH ^3.4作为移动相，在薄层色谱 （TLC） 板 （聚乙烯改性纤维素 TLC 板） 上运行 1 μL 的样品，分析 32 个 P-pppgpp 和₃₂个 P-ppGpp。
   注:使用^α-32P标签瓜诺辛5'-三磷酸盐（32P-α-GTP）作为控制。
6. 将 TLC 板完全干燥，放在透明塑料文件夹之间，并将其暴露在存储磷屏上 5 分钟。使用磷化剂可视化和量化信号。
   注:当 ³²个P-pppGpp和 ³²个P-ppGpp的比例高于85%时，可以通过使用 表1进行大规模反应（500微升，足以筛选20个96井板）。

4. Dracala 筛选目标蛋白质 （p） p. pgpp

1. 解冻并转移 20 微升整个细胞解冻剂到 96 井 V 底微提亚板。从 塞拉蒂亚马塞森加入2.5U/井内分泌酶，在37°C下孵育15分钟，以降低莱萨特粘度。将解冻剂放在冰上20分钟。
2. 将 ³²PppGpp 和 ³²PppGpp 混合在 1:1 的比例中，并添加 1 倍裂解缓冲 L1，使 （p）pppGpp 的最终浓度等于 4 nM。
   注:鉴于 pppGpp 和 ppGpp 的化学相似性，这两种化学品的混合将简化筛选过程。
3. 使用多通道移液器和过滤移液器提示添加和混合 10 μL 的 （p）ppGpp 混合物与细胞解分析器。在室温下孵育 5 分钟。
4. 将 0.01% 的非离子洗涤剂溶液放入 30s 中，并在纸巾上干燥 30s，从而清洗 96 x 针工具。重复洗净引脚工具 3 倍。
5. 将引脚工具放在上面的 96 井样品板中，等待 30s。将销工具直接向上抬起，并将其直接放置在硝基纤维素膜上 30 秒。
   注意:如果缺少一个点，请用移液器和过滤提示发现相应的样品的 2 μL。建议对下文所示的相同样本进行重复点。
6. 在 RT 处将膜干燥 5 分钟，将膜放在透明塑料文件夹之间，并将其暴露在存储磷屏上 5 分钟。使用磷化法可视化。

5. 潜在目标蛋白的量化和鉴定

1. 使用与磷化器相关的分析软件打开可视化板的 .gel 文件。使用 阵列分析 功能，通过设置由 12 列 x 8 行组成的网格来定义 96 个点。
2. 定义大圆圈以限制整个点的外缘（见 图1B）。导出定义的大圆圈的 Volumn®背景 和 区域 ，并保存在电子表格中。
   注:如果需要，重新定位每个圆，使其与点完全重叠，并调整每个圆圈的大小，使其略大于实际点。
3. 向下大小定义的圆，以限制小内点。导出 Volumn+背景和定义的小圆圈 区域 ，并保存在电子表格中。
4. 使用 图 1B中的方程计算电子表格中的绑定分数，并绘制数据图。与其他大多数油井相比，确定油井中具有高结合分数的潜在结合蛋白。

图2:DRACALA筛选过程的总体工作流程。 从 大肠杆菌 ASKA集合产生的蛋白质被诱导，细胞被解解。同时，重组蛋白Rel_seq-他和GppA-His被净化，用于合成 ³²个P标签的ppgpp和ppGpp从 ³²个P-α-GTP。放射性标记 （p） ppGpp 分子随后与解糖混合，并使用 96 针工具在硝基纤维素膜上发现混合物，以便随后暴露在磷存储屏、成像和放射性信号定量中。缩写: Dracala = 利甘德分析的差速径向毛细管操作;（p） ppgpp = 瓜诺辛五角星和四磷酸盐;RT = 室温;Iptg = 异丙基β - d - 1 - 硫高卢托皮拉诺赛德;GTP = 瓜诺辛 5'-三磷酸盐;SDS-PAGE = 钠二甲基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳;TLC = 薄层色谱。 请单击此处查看此图的较大版本。

结果

遵循上述协议通常会产生两种类型的结果（图3）。

图 3A显示大多数油井的背景绑定信号相对较低的板（绑定分数< 0.025）。来自油井 H3 的正绑定信号给出的绑定分数为 ±0.35，远远高于其他油井的绑定分数。即使没有量化，H3 也非常显著，表明 H3 中表达的目标蛋白质与 pppGpp、ppGpp 或两者兼有。事实上，在H3井中过度表达的蛋白质是...

讨论

进行 DRACALA 筛查的关键步骤之一是获得良好的全细胞解解。首先，测试的蛋白质应大量和可溶性地生产。其次，细胞的裂解应完成，裂解剂的粘度必须极小。酶的加入和三个冷冻-解冻周期的使用往往足以完全解冻细胞。然而，释放的染色体DNA使溶质粘稠，并产生高背景结合信号，导致误报如图3B，C所示。为了减轻这种情况，可以使用来自S.马塞森的Dnase 1?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x pin tool	V&P Scientific	VP 404	96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long
96-well V-bottom microtiter plate	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA collection strain	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
gel filtration10x300 column	GE Healthcare	28990944	contains 20% ethanol as preservative
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glycerol 87% for analysis
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP Storage Phosphor Screen	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropyl β-D-thiogalactoside
Lysogeny Broth (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Broth Base
Lysozyme	SIGMA	L4949	from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98%
MgCl2 (Magnesium chloride)	SIGMA	208337
MilliQ water			ultrapure water
multichannel pipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitrocellulose Blotting Membrane	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)	SIGMA	202444
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	SIGMA	93482	Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)
Phosphor-imager	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager
Pipette Tips, filtered	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μl nonsterile
Poly-Prep Chromatography column	Bio-Rad	7311550	polypropylene chromatography column
Protease inhibitor Mini	Pierce	A32955	Tablets, EDTA-free
screw cap tube	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile
SLS 96-deep Well plates	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural
spin column	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base for Molecular Biology
Tween 20	SIGMA	P1379	viscous non-ionic detergent
β-mercaptoethanol	SIGMA	M3148	99% (GC/titration)