Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

Resumo

A Ação Capilar De Ligania Diferencial do Ensaio de Ligamento (DRaCALA) pode ser usada para identificar pequenas proteínas de ligação de ligantes de um organismo usando uma biblioteca ORFeome.

Resumo

A última década teve um tremendo progresso na compreensão de pequenas moléculas de sinalização na fisiologia bacteriana. Em particular, as proteínas-alvo de vários mensageiros secundários derivados de nucleotídeos (NSMs) têm sido sistematicamente identificadas e estudadas em organismos modelo. Essas conquistas se devem principalmente ao desenvolvimento de várias novas técnicas, incluindo a técnica do composto de captura e a ação capilar radial diferencial do ensaio ligante (DRaCALA), que foram utilizadas para identificar sistematicamente proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Este artigo descreve o uso dos NSMs, guanosine penta e tetrafosfatos (p)ppGpp, como exemplo e demonstração de vídeo da técnica DRaCALA. Utilizando DRaCALA, 9 das 20 proteínas-alvo conhecidas e 12 novas proteínas-alvo de (p)ppGpp foram identificadas no organismo modelo, Escherichia coli K-12, demonstrando o poder deste ensaio. Em princípio, o DRaCALA poderia ser usado para estudar pequenos ligantes que podem ser rotulados por isótopos radioativos ou corantes fluorescentes. Os passos críticos, prós e contras do DRaCALA são discutidos aqui para posterior aplicação desta técnica.

Introdução

As bactérias usam várias pequenas moléculas de sinalização para se adaptar em ambientes em constante mudança^1,2. Por exemplo, os autoindutores, N-acylhomoserine lactones e seus oligopeptídeos modificados, mediam a comunicação intercelular entre bactérias para coordenar o comportamento populacional, um fenômeno conhecido como quórum sensoriando². Outro grupo de pequenas moléculas de sinalização são os NSMs, incluindo o monofosfato de adenosina cíclica amplamente estudado (cAMP), di-AMP cíclico, monofosfato de di-guanosina cíclico (di-GMP cíclico), e penta-e tetra fosfatos (p)ppGpp¹. As bactérias produzem esses NSMs como resposta a uma variedade de diferentes condições de estresse. Uma vez produzidas, essas moléculas se ligam às suas proteínas-alvo e regulam várias vias fisiológicas e metabólicas diferentes para lidar com as tensões encontradas e aumentar a sobrevivência bacteriana. Portanto, a identificação das proteínas alvo é um pré-requisito inevitável para decifrar as funções moleculares dessas pequenas moléculas.

A última década testemunhou um boom de conhecimento dessas pequenas moléculas de sinalização, principalmente devido a várias inovações técnicas que revelaram as proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Estes incluem a técnica do composto de captura^3,4,5, e a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligantes (DRaCALA)⁶ a ser discutido neste artigo.

Inventado por Vincent Lee e colegas de trabalho em 2011^6,o DRaCALA implanta a capacidade de uma membrana nitrocelulose para sequestrar diferencialmente ligantes livres e ligados à proteína. Moléculas como proteínas não podem se difundir em uma membrana de nitrocelulose, enquanto pequenos ligantes, como os NSMs, são capazes de. Ao misturar o NSM (por exemplo,ppGpp) com a proteína a ser testada e localizá-las na membrana, dois cenários podem ser esperados (Figura 1): Se (p)ppGpp se ligar à proteína, o radiolabeled (p)ppGpp será mantido no centro do local pela proteína e não se difundirá para fora, dando um pequeno ponto intenso (i.e., forte sinal radioativo) sob um fosforrimager. No entanto, se (p)ppGpp não se ligar à proteína, ele irá difundir livremente para fora para produzir um grande ponto com sinal radioativo de fundo uniforme.

Além disso, o DRaCALA pode detectar a interação entre uma pequena molécula e uma proteína não purificada em uma célula inteira lysate se a proteína estiver presente em uma quantidade suficiente. Essa simplicidade permite o uso de DRaCALA na identificação rápida de alvos proteicos usando uma biblioteca de expressão ORFeome. De fato, as proteínas-alvo de cAMP^7,cíclico di-AMP^8,di-GMP^{ciclic 9,10}e (p)ppGpp^11,12,13 foram sistematicamente identificadas pelo uso de DRaCALA. Este artigo de vídeo usa (p)ppGpp como um exemplo para demonstrar e descrever as etapas e considerações críticas na realização de uma triagem DRaCALA bem sucedida. Note-se que uma descrição mais completa do DRaCALA¹⁴ é altamente recomendada para ler em combinação com este artigo antes de realizar o DRaCALA.

Figura 1: O princípio da DRaCALA. (A) Esquema do ensaio DRaCALA. Consulte o texto para obter detalhes. (B) Quantificação e cálculo da fração vinculante. Consulte o texto para obter detalhes. Resumidamente, as manchas DRaCALA serão analisadas desenhando dois círculos que circunscrevem todo o local e o ponto escuro interno (ou seja,o retido (p)ppGpp devido à ligação da proteína testada). O sinal de ligação específico é o sinal radioativo do círculo interno (S1) após subtrair o sinal de fundo não específico (calculado por A₁ × ((S₂-S₁)/(A₂-A₁)). A fração de ligação é o sinal de ligação específico dividido pelo sinal radioativo total (S2). Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Preparação de lises celulares inteiras

1. Inocular a coleção E. coli K-12 ASKA ORFeome estica¹⁵ em 1,5 mL Caldo de Lysogeny (LB) contendo 25 μg/mL chloramphenicol em placas de poços profundos de 96. Cresça durante a noite (O/N) por 18 h a 30 °C com agitação a 160 rpm. No dia seguinte, adicione isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final de 0,5 mM) às culturas O/N para induzir expressão proteica a 30 °C por 6 h.
2. Células de pelota a 500 x g por 10 min. Congele as pelotas a -80 °C até usar. Para lise as células, adicione 150 μL de tampão de lise L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonyl de 2 mM (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 e 0,5 mg/mL de lysozime) para ressususpensar a pelota.
3. Congele as células a -80 °C por 30 min e descongele a 37 °C por 20 min. Repita este ciclo três vezes para lise as células. Armazene as lises a -80 °C antes de usar.

2. Purificação de Rel_seq e GppA

NOTA: As proteínas recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis e GppA de E. coli K-12 são usadas para sintetizar o pppGpp radiolabeled e ppGpp, respectivamente.

1. Crescer e coletar células superexpressando cada proteína.
   1. Cresça a cepa E. coli BL21 DE3 até a fase exponencial (densidade óptica (OD) ~0,3-0,4) em caldo LB, e gire 1 mL de cultura a 6000 x g por 5 min. Decante o supernascimento, e resuspenja as células com 100 μL de caldo TSB gelado (caldo LB suplementado com 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/meL dimetilsulfoxida, 20 mM MgCl₂).
   2. Misture os plasmídeos com o rel_seq e gppAmarcados por histidina, cada 100 ng, com as suspensões celulares acima em TSB, e incubar no gelo por 30 minutos. Choque térmico das células a 42 °C para 40 s. Coloque a mistura no gelo por 2 min, e adicione 1 mL de caldo LB à temperatura ambiente para permitir que as células se recuperem por 1h a 37 °C com agitação a 160 rpm.
   3. Placa as células recuperadas em placas de ágar LB suplementadas com os antibióticos correspondentes (Rel_seq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). No dia seguinte, inocular as colônias em caldo LB para iniciar as pré-culturas O/N de ambas as cepas a 37 °C.
   4. Após 18 h, inocular 500 mL de meio LB com 10 mL das culturas O/N e os antibióticos correspondentes. Cresça as culturas agitando a 160 rpm a 37 °C. Quando o OD_600nm atingir 0,5-0,7, induzir expressão proteica adicionando 0,5 mM IPTG e crescendo por 3h a 30 °C com agitação a 160 rpm.
   5. Colete as células girando a 6084 x g por 10 min a 4 °C. Resuspense a pelota em 20 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) e re-centrífuga a 1912 x g por 20 min a 4 °C. Decante o supernatante e congele as pelotas a -20 °C antes de usar.
2. Purificação de afinidade do ácido nitrilotriactico de níquel (Ni-NTA)
   NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que as amostras estão frias.
   1. Adicione 40 mL de tampão de lise gelada L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoetanol complementado com inibidores de protease (comprimido livre de EDTA; ver a Tabela de Materiais) para resuspensar a pelota. Lise as células através de sônica (60% de amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF por 8 min ON). Limpe o lise girando a 23.426 x g por 40 min a 4 °C, e continue com o sobrenatante para a purificação.
   2. Durante a centrifugação acima, prepare a resina Ni-NTA.
      1. Transfira 500 μL de resina Ni-NTA homogeneizada para uma coluna de cromatografia de polipropileno em pé, e deixe-a se contentar com 15 minutos e a solução de armazenamento escorra. Lave a resina com 15 mL de água ultrauso duas vezes e depois lave a coluna com 15 mL do tampão de lise L2.
   3. Carregue o supernanato limpo de lise celular do passo 1 para a coluna, e deixe-o fluir. Lave a coluna com 30 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 20 mM imidazole).
   4. Elute as proteínas com 400 μL do tampão de eluição (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazol) três vezes. Em seguida, repita a elução com outros 300 μL do buffer de eluição. Combine as proteínas elucidas a um volume final de 700 μL.
3. Filtragem de gel
   1. Prepare o tampão de filtragem de gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol). Lave a coluna de exclusão de tamanho com um volume de coluna (25 mL) do tampão de filtragem de gel.
   2. Carregue a amostra acima de 700 μL usando um loop de 500 μL, execute a 0,5 mL/min e colete 2-3 frações, cada uma de 0,5 mL de volume, contendo as respectivas proteínas.
   3. Combine e concentre as frações que contêm cada uma das proteínas usando uma coluna de spin, e meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.

3. Síntese de PPPGpp e ppGpp com etiqueta em P de ³²P

1. Monte uma reação rel_seq em pequena escala em um tubo de tampa de parafuso (ver Tabela 1).
   NOTA: Trabalhe com reagentes radioativos apenas em local licenciado e com equipamento de proteção individual.

	Volume (μL)
	Pequena escala	Grande escala
Água ultrapura
10x Relseq buffer*	2	50
ATP (final de 8 mM)
Relseq (4 μM final)
32 Triptofato P-α-Guanosine (GTP) (final 120 nM) (ATENÇÃO)	0.2	5
total	20	500

Tabela 1: A montagem de informações para as reações de síntese de pequena e grande escala de pppGpp. *10x Relseq buffer contém 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abreviação: pppGpp = pentafosfato de guanosina.

2. Incubar o tubo a 37 °C em um termomixer por 1h, depois a 95 °C por 5 min, e coloque no gelo por 5 min. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante ^{(sintetizado 32}P-pppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.
3. Para sintetizar ³²P-ppGpp de ³²P-pppGpp, transfira metade do produto ³²p-pppGpp para um novo tubo de tampa de parafuso e adicione 1 μM GppA. Incubar o tubo a 37 °C por 10 min, a 95 °C por 5 min, e depois coloque no gelo por 5 minutos.
4. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante ^{(sintetizado 32}P-ppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.
5. Analise a placa ^{de 32}P-pppGpp e ³²P-ppGpp executando 1 μL das amostras em uma placa de cromatografia de camada fina (TLC) (placas TLC modificadas por polietileneimina) utilizando as placas TLC 1,5 M KH₂PO₄, pH 3.4, como fase móvel.
   NOTA: Use o α-³²P-rotulado guanosina 5'-triphosphate (³²P-α-GTP) como controle.
6. Seque completamente a placa TLC, coloque-a entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize e quantifique os sinais usando um fósforo.
   NOTA: Quando as proporções de ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp forem superiores a 85%, uma reação em larga escala (500 μL, suficiente para triagem de 20 placas de 96 poços) pode ser montada e sintetizada usando a Tabela 1.

4. Triagem DRaCALA das proteínas-alvo de (p)ppGpp

1. Descongele e transfira 20 μL de lises celulares inteiras para uma placa de microtiter fundo V de 96 poços. Adicione 2,5 U/poço de endonuclease de Serratia marcescens, e incubar a 37 °C por 15 min para reduzir a viscosidade lysate. Coloque os lises no gelo por 20 minutos.
2. Misture o ^{tampão de 32}P-pppGpp e ³²P-ppGpp em uma proporção de 1:1, e adicione 1x tampão de lise L1 para tornar a concentração final de (p)ppGpp igual a 4 nM.
   NOTA: Dada a similaridade química entre o pppGpp e o ppGpp, uma mistura de ambos os produtos químicos simplificará o processo de triagem.
3. Use uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas para adicionar e misturar 10 μL da mistura (p)ppGpp com o lise celular. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
4. Lave a ferramenta de 96 x pino colocando em 0,01% a solução de detergente não iônico para 30 s e seque em um papel de tecido para 30 s. Repita a lavagem da ferramenta do pino 3x.
5. Coloque a ferramenta de pinos nas placas de amostra acima de 96 poços e espere por 30 s. Levante a ferramenta do pino para cima e coloque-a em linha reta para baixo em uma membrana de nitrocelulose por 30 s.
   NOTA: Se faltar uma mancha, local 2 μL das amostras correspondentes com uma pipeta e pontas filtradas. É aconselhável fazer um ponto duplicado da mesma amostra que indicado abaixo.
6. Seque a membrana por 5 minutos no RT. Coloque a membrana entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize usando um fósforo.

5. Quantificação e identificação de potenciais proteínas-alvo

1. Use o software de análise associado ao fosforrimager para abrir o arquivo .gel das placas visualizadas. Use a função de análise Array para definir os 96 pontos configurando uma grade de 12 colunas x 8 linhas.
2. Defina círculos grandes para circunscrever a borda externa de todos os pontos (ver Figura 1B). Exporte o Volumn+Background e Área dos grandes círculos definidos e economize em uma planilha.
   NOTA: Se necessário, reposicione cada círculo individual para se sobrepor perfeitamente com as manchas e redimensione cada círculo individual para torná-lo ligeiramente maior do que o local real.
3. Dimensione os círculos definidos para circunscrever os pequenos pontos internos. Exporte o Volumn+Backgrounde Área dos pequenos círculos definidos e economize em uma planilha.
4. Calcule as frações de vinculação na planilha usando a equação na Figura 1Be plote os dados. Identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.

Figura 2: Fluxo de trabalho global do processo de triagem DRaCALA. A produção de proteínas de uma coleção Escherichia coli ASKA é induzida, e as células são lístidas. Enquanto isso, as proteínas recombinantes Rel_seq-His e GppA-His são purificadas e usadas para sintetizar pppGpp e ppGpp de ³²P-α-GTP. As moléculas de ppGpp radioativamente rotuladas (p)ppGpp são então misturadas com os lises, e uma ferramenta de 96 pinos é usada para detectar as misturas em uma membrana nitrocelulose para posterior exposição a uma tela de armazenamento de fósforo, imagem e quantificação dos sinais radioativos. Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosina 5'-triphosfato; SDS-PAGE = eletroforese de gel de dodecylsulfato-poliacrilamida de sódio ; TLC = cromatografia de camada fina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Seguindo o protocolo acima descrito normalmente produzirá dois tipos de resultados (Figura 3).

A Figura 3A mostra uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos (frações de ligação < 0,025) da maioria dos poços. O sinal de ligação positivo do poço H3 dá uma fração de ligação de ~0,35 que é muito maior do que a observada para os outros poços. Mesmo sem quantificação, bem H3 é notável, sugerindo que ...

Discussão

Uma das etapas críticas na realização da triagem DRaCALA é obter bons lises celulares inteiras. Em primeiro lugar, as proteínas testadas devem ser produzidas em grandes quantidades e em formas solúveis. Em segundo lugar, a lise das células deve estar completa, e a viscosidade do lysate deve ser mínima. A inclusão da lise e o uso de três ciclos de congelamento são muitas vezes suficientes para lise completamente as células. No entanto, o DNA cromossômico liberado torna o viscoso lísato e gera alto sinal de l...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x pin tool	V&P Scientific	VP 404	96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long
96-well V-bottom microtiter plate	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA collection strain	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
gel filtration10x300 column	GE Healthcare	28990944	contains 20% ethanol as preservative
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glycerol 87% for analysis
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP Storage Phosphor Screen	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropyl β-D-thiogalactoside
Lysogeny Broth (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Broth Base
Lysozyme	SIGMA	L4949	from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98%
MgCl2 (Magnesium chloride)	SIGMA	208337
MilliQ water			ultrapure water
multichannel pipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitrocellulose Blotting Membrane	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)	SIGMA	202444
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	SIGMA	93482	Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)
Phosphor-imager	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager
Pipette Tips, filtered	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μl nonsterile
Poly-Prep Chromatography column	Bio-Rad	7311550	polypropylene chromatography column
Protease inhibitor Mini	Pierce	A32955	Tablets, EDTA-free
screw cap tube	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile
SLS 96-deep Well plates	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural
spin column	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base for Molecular Biology
Tween 20	SIGMA	P1379	viscous non-ionic detergent
β-mercaptoethanol	SIGMA	M3148	99% (GC/titration)