Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

Résumé

L’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) peut être utilisée pour identifier les petites protéines de liaison au ligand d’un organisme à l’aide d’une bibliothèque ORFeome.

Résumé

La dernière décennie a vu d’énormes progrès dans la compréhension des petites molécules de signalisation dans la physiologie bactérienne. En particulier, les protéines cibles de plusieurs messagers secondaires dérivés de nucléotides (NSM) ont été systématiquement identifiées et étudiées dans des organismes modèles. Ces réalisations sont principalement dues au développement de plusieurs nouvelles techniques dont la technique du composé de capture et l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands (DRaCALA), qui ont été utilisées pour identifier systématiquement les protéines cibles de ces petites molécules. Cet article décrit l’utilisation des NSM, de la guanosine penta- et des tétraphosphates (p)ppGpp, à titre d’exemple et de démonstration vidéo de la technique DRaCALA. En utilisant DRaCALA, 9 des 20 protéines cibles connues et 12 nouvelles de (p)ppGpp ont été identifiées dans l’organisme modèle, Escherichia coli K-12, démontrant la puissance de ce test. En principe, DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier de petits ligands qui peuvent être marqués par des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Les étapes critiques, les avantages et les inconvénients de DRaCALA sont discutés ici pour une application ultérieure de cette technique.

Introduction

Les bactéries utilisent plusieurs petites molécules de signalisation pour s’adapter à des environnements en constante évolution^1,2. Par exemple, les auto-inducteurs, les lactones N-acylhomosérine et leurs oligopeptides modifiés, médient la communication intercellulaire entre les bactéries pour coordonner le comportement de la population, un phénomène connu sous le nom de quorum sensing^2. Un autre groupe de petites molécules de signalisation est les NSM, y compris l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), le di-AMP cyclique, la di-guanosine monophosphate cyclique (di-GMP cyclique) et les penta- et tétraphosphates de guanosine (p)ppGpp¹. Les bactéries produisent ces NSM en réponse à une variété de conditions de stress différentes. Une fois produites, ces molécules se lient à leurs protéines cibles et régulent plusieurs voies physiologiques et métaboliques différentes pour faire face aux stress rencontrés et améliorer la survie bactérienne. Par conséquent, l’identification des protéines cibles est une condition préalable inévitable pour déchiffrer les fonctions moléculaires de ces petites molécules.

La dernière décennie a été témoin d’un boom des connaissances sur ces petites molécules de signalisation, principalement en raison de plusieurs innovations techniques qui ont dévoilé les protéines cibles de ces petites molécules. Il s’agit notamment de la technique du composé de capture^3,4,⁵et de l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)⁶ qui sera discutée dans cet article.

Inventé par Vincent Lee et ses collègues en 2011^6,DRaCALA déploie la capacité d’une membrane de nitrocellulose à séquestrer différemment des ligands libres et liés aux protéines. Les molécules telles que les protéines ne peuvent pas diffuser sur une membrane de nitrocellulose, tandis que de petits ligands, tels que les NSM, sont capables de le faire. En mélangeant le NSM(par exemple,ppGpp) avec la protéine à tester et en les repérant sur la membrane, on peut s’attendre à deux scénarios (Figure 1): Si (p)ppGpp se lie à la protéine, le (p)ppGpp radiomarqué sera retenu au centre de la tache par la protéine et ne diffusera pas vers l’extérieur, donnant un petit point intense(c’est-à-dire, signal radioactif fort) sous un imageur phosphoré. Cependant, si (p)ppGpp ne se lie pas à la protéine, elle diffusera librement vers l’extérieur pour produire une grande tache avec un signal radioactif de fond uniforme.

De plus, DRaCALA peut détecter l’interaction entre une petite molécule et une protéine non purifiée dans un lysate cellulaire entier si la protéine est présente en quantité suffisante. Cette simplicité permet l’utilisation de DRaCALA dans l’identification rapide de cibles protéiques à l’aide d’une bibliothèque d’expression ORFeome. En effet, les protéines cibles de l’AMPc^7,du di-AMP8^cyclique,du di-GMP^{cyclique 9,10}et du (p)ppGpp^11,12,13 ont été systématiquement identifiées à l’aide de DRaCALA. Cet article vidéo utilise (p)ppGpp comme exemple pour démontrer et décrire les étapes et les considérations critiques dans la réalisation d’un dépistage DRaCALA réussi. Il est à noter qu’il est fortement recommandé de lire une description plus complète de DRaCALA¹⁴ en combinaison avec cet article avant d’effectuer DRaCALA.

Figure 1: Le principe de DRaCALA. (A) Schéma du test DRaCALA. Voir le texte pour plus de détails. (B) Quantification et calcul de la fraction liante. Voir le texte pour plus de détails. En bref, les taches DRaCALA seront analysées en dessinant deux cercles qui circonscrivent la tache entière et le point sombre interne(c’est-à-direle (p)ppGpp retenu en raison de la liaison de la protéine testée). Le signal de liaison spécifique est le signal radioactif du cercle intérieur (S1) après soustraction du signal de fond non spécifique (calculé par A₁ × ((S₂-S₁)/(A₂-A₁))). La fraction de liaison est le signal de liaison spécifique divisé par le signal radioactif total (S2). Abréviations: DRaCALA = Action capillaire radiale différentielle du test de ligand; (p)ppGpp = guanosine penta- et tétraphosphates; RT = température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation de lysates de cellules entières

1. Inoculer les souches de collecte E. coli K-12 ASKA ORFeome¹⁵ dans un bouillon de lysogénie (LB) de 1,5 mL contenant 25 μg/mL de chloramphénicol dans des plaques de puits profondes de 96 puits. Cultiver pendant la nuit (O/N) pendant 18 h à 30 °C en agitant à 160 tr/min. Le lendemain, ajouter l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final 0,5 mM) aux cultures O/N pour induire l’expression des protéines à 30 °C pendant 6 h.
2. Cellules à granulés à 500 x g pendant 10 min. Congeler les granulés à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Pour lyser les cellules, ajouter 150 μL de tampon de lyse L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, complété par 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 40 μg/mL de DNase 1 et 0,5 mg/mL de lysozyme) pour ressusposer la pastille.
3. Congeler les cellules à -80 °C pendant 30 min, puis décongeler à 37 °C pendant 20 min. Répétez ce cycle trois fois pour lyser les cellules. Conserver les lysates à -80 °C avant utilisation.

2. Purification de Rel_seq et GppA

REMARQUE: Les protéines recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis et GppA de E. coli K-12 sont utilisées pour synthétiser les pppGpp et ppGpp radiomarqués, respectivement.

1. Cultiver et collecter des cellules surexprimant chaque protéine.
   1. Cultiver la souche E. coli BL21 DE3 jusqu’à la phase exponentielle (densité optique (OD) ~ 0,3-0,4) dans le bouillon LB et faire tourner 1 mL de culture à 6000 x g pendant 5 min. Décanter le surnageant et ressuspender les cellules avec 100 μL de bouillon de BST glacé (bouillon LB complété par 0,1 g/mL de PEG3350, 0,05 mL/mL de diméthylsulfoxyde, 20 mM_MgCl2).
   2. Mélanger les plasmides portant le rel seq et le gppAmarqués à _{l’histidine,} chacun de 100 ng, avec les suspensions cellulaires ci-dessus dans le TSB, et incuber sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique des cellules à 42 °C pendant 40 s. Placer le mélange sur de la glace pendant 2 min, et ajouter 1 mL de bouillon LB à température ambiante pour permettre aux cellules de récupérer pendant 1 h à 37 °C avec agitation à 160 tr/min.
   3. Plaquer les cellules récupérées sur des plaques de gélose LB complétées par les antibiotiques correspondants (Rel_seq:100 μg/mL d’ampicilline; GppA : 30 μg/mL de kanamycine). Le lendemain, inoculez les colonies dans du bouillon LB pour commencer les précultures O/N des deux souches à 37 °C.
   4. Après 18 h, inoculer 500 mL de milieu LB avec 10 mL des cultures O/N et des antibiotiques correspondants. Cultivez les cultures en les agitant à 160 tr/min à 37 °C. Lorsque la DO_600nm atteint 0,5-0,7, induire l’expression des protéines en ajoutant 0,5 mM d’IPTG et en augmentant pendant 3 h à 30 °C en agitant à 160 tr/min.
   5. Prélever les cellules en les tournant à 6084 x g pendant 10 min à 4 °C. Resuspendez la pastille dans 20 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS) et recentrifugez à 1912 x g pendant 20 min à 4 °C. Décantez le surnageant et congelez les granulés à -20 °C avant utilisation.
2. Purification par affinité de l’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA)
   REMARQUE: À partir de ce moment, assurez-vous que les échantillons sont froids.
   1. Ajouter 40 mL de tampon de lyse glacé L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM naCl, 5 % de glycérol, 10 mM d’imidazole, 10 mM de β-mercaptoéthanol complété par des inhibiteurs de la protéase (comprimé sans EDTA; voir la table des matériaux)pour ressuspender la pastille. Lyser les cellules par sonication (amplitude de 60%, 2 s ON / 4 s OFF pendant 8 min ON). Nettoyer le lysate en filant à 23 426 x g pendant 40 min à 4 °C, et continuer avec le surnageant pour la purification.
   2. Pendant la centrifugation ci-dessus, préparez la résine Ni-NTA.
      1. Transférer 500 μL de résine Ni-NTA homogénéisée dans une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied et laisser se déposer pendant 15 min et la solution de stockage s’écouler à travers. Lavez la résine avec 15 mL d’eau ultrapure deux fois, puis lavez la colonne avec 15 mL du tampon de lyse L2.
   3. Chargez le surnageant dégagé du lysate de cellule de l’étape 1 sur la colonne et laissez-le s’écouler. Laver la colonne avec 30 mL de tampon de lavage (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 20 mM d’imidazole).
   4. Éluez les protéines avec 400 μL du tampon d’élution (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 500 mM imidazole) trois fois. Ensuite, répétez l’élution avec 300 μL de plus du tampon d’élution. Combiner les protéines éluées pour un volume final de 700 μL.
3. Filtration sur gel
   1. Préparer un tampon de filtration en gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% de glycérol). Lavez la colonne d’exclusion de taille avec un volume de colonne (25 mL) du tampon de filtration en gel.
   2. Chargez l’échantillon de 700 μL ci-dessus à l’aide d’une boucle de 500 μL, exécutez à 0,5 mL / min et collectez 2 à 3 fractions, chacune de volume de 0,5 mL, contenant les protéines respectives.
   3. Combinez et concentrez les fractions contenant chacune des protéines à l’aide d’une colonne de spin et mesurez la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford.

3. Synthèse de ³²pppGpp et ppGpp marqués P

1. Assembler une réaction Rel_seq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis (voir tableau 1).
   REMARQUE : Travailler avec des réactifs radioactifs uniquement dans un endroit autorisé et avec de l’équipement de protection individuelle.

	Volume (μL)
	Petite échelle	À grande échelle
Eau ultrapure
10x Relseq buffer*	2	50
ATP (finale 8 mM)
Relseq (4 μM final)
32 P-α-Guanosine triphosphate (GTP) (final 120 nM) (ATTENTION)	0.2	5
total	20	500

Tableau 1 : Informations d’assemblage pour les réactions de synthèse à petite et à grande échelle de ³²pppGpp marqués P. *10x Le tampon Relseq contient 250 mM de Tris-HCl, pH 8,6 ; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abréviation : pppGpp = guanosine pentaphosphate.

2. Incuber le tube à 37 °C dans un thermomélangeur pendant 1 h, puis à 95 °C pendant 5 min, et placer sur de la glace pendant 5 min. Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min et transférez le surnageant (synthétisé ³²P-pppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.
3. Pour synthétiser ³²P-ppGpp à partir de ³²P-pppGpp, transférez la moitié du produit ³²p-pppGpp dans un nouveau tube à bouchon à vis et ajoutez 1 μM GppA. Incuber le tube à 37 °C pendant 10 min, à 95 °C pendant 5 min, puis placer sur de la glace pendant 5 min.
4. Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min et transférez le surnageant (synthétisé ³²P-ppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.
5. Analyser les ³²P-pppGpp et ³²P-ppGpp en faisant fonctionner 1 μL des échantillons sur une plaque de chromatographie sur couche mince (TLC) (plaques TLC de cellulose modifiée à la polyéthylèneimine) en utilisant le 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, comme phase mobile.
   REMARQUE: Utilisez le^α-32P-marqué guanosine 5'-triphosphate⁽³²P-α-GTP) comme témoin.
6. Séchez complètement la plaque TLC, placez-la entre un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 minutes. Visualisez et quantifiez les signaux à l’aide d’un phosphorimager.
   REMARQUE: Lorsque les rapports de ³²P-pppGpp et ³²P-ppGpp sont supérieurs à 85%, une réaction à grande échelle (500 μL, suffisant pour le criblage de 20 plaques de 96 puits) peut être assemblée et synthétisée à l’aide du tableau 1.

4. Dépistage DRaCALA des protéines cibles de (p)ppGpp

1. Décongeler et transférer 20 μL de lysates de cellules entières vers une plaque de microtitrage à fond en V de 96 puits. Ajouter 2,5 U/puits d’endonucléase de Serratia marcescenset incuber à 37 °C pendant 15 min pour réduire la viscosité du lysate. Placez les lysates sur de la glace pendant 20 min.
2. Mélanger les ³²P-pppGpp et ³²P-ppGpp dans un rapport de 1:1, et ajouter 1x tampon de lyse L1 pour que la concentration finale de (p)ppGpp soit égale à 4 nM.
   REMARQUE: Compte tenu de la similitude chimique entre pppGpp et ppGpp, un mélange des deux produits chimiques simplifiera le processus de criblage.
3. Utilisez une pipette multicanal et des embouts de pipette filtrés pour ajouter et mélanger 10 μL du mélange (p)ppGpp avec le lysate cellulaire. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
4. Lavez l’outil à 96 broches en le plaçant dans une solution à 0,01% de détergent non ionique pendant 30 s et séchez-le sur un papier de soie pendant 30 s. Répétez le lavage de l’outil de broche 3x.
5. Placez l’outil à broches dans les plaques d’échantillonnage de 96 puits ci-dessus et attendez 30 s. Soulevez l’outil à goupille vers le haut et placez-le directement sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 s.
   REMARQUE: S’il manque un point, repérez 2 μL des échantillons correspondants avec une pipette et des pointes filtrées. Il est conseillé de faire une tache dupliquée du même échantillon comme indiqué ci-dessous.
6. Sécher la membrane pendant 5 min à TA. Placez la membrane entre un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 min. Visualisez à l’aide d’un phosphorimageur.

5. Quantification et identification des protéines cibles potentielles

1. Utilisez le logiciel d’analyse associé au phosphorimager pour ouvrir le fichier .gel des plaques visualisées. Utilisez la fonction d’analyse Array pour définir les 96 points en configurant une grille de 12 colonnes x 8 lignes.
2. Définissez de grands cercles pour circonscrire le bord extérieur de l’ensemble des taches (voir Figure 1B). Exportez volumn+background et area des grands cercles définis et enregistrez-les dans une feuille de calcul.
   REMARQUE: Si nécessaire, repositionnez chaque cercle individuel pour qu’il se chevauche parfaitement avec les taches et redimensionnez chaque cercle individuel pour le rendre légèrement plus grand que le point réel.
3. Dimensionnez les cercles définis pour circonscrire les petits points intérieurs. Exportez Volumn+Backgroundet Area des petits cercles définis, puis enregistrez-les dans une feuille de calcul.
4. Calculez les fractions de liaison dans la feuille de calcul à l’aide de l’équation de la figure 1Bet tracez les données. Identifier les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.

Figure 2: Flux de travail global du processus de sélection DRaCALA. La production de protéines à partir d’une collection Escherichia coli ASKA est induite et les cellules sont lysées. Pendant ce temps, les protéines recombinantes Rel_seq-Hiset GppA-His sont purifiées et utilisées pour synthétiser ³²pppGpp et ppGpp marqués P à partir de ³²P-α-GTP. Les molécules (p)ppGpp radioactivement étiquetées sont ensuite mélangées avec les lysates, et un outil à 96 broches est utilisé pour repérer les mélanges sur une membrane de nitrocellulose pour une exposition ultérieure à un écran de stockage du phosphore, l’imagerie et la quantification des signaux radioactifs. Abréviations: DRaCALA = Action capillaire radiale différentielle du test de ligand; (p)ppGpp = guanosine penta- et tétraphosphates; RT = température ambiante; IPTG = isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosine 5'-triphosphate; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium ; TLC = chromatographie sur couche mince. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Suivre le protocole décrit ci-dessus donnera généralement deux types de résultats (Figure 3).

La figure 3A montre une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles (fractions de liaison < 0,025) provenant de la majorité des puits. Le signal de liaison positif du puits H3 donne une fraction de liaison d’environ 0,35 qui est beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits. Même sans quantificat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L’une des étapes critiques dans la réalisation du dépistage DRaCALA est d’obtenir de bons lysates de cellules entières. Tout d’abord, les protéines testées doivent être produites en grande quantité et sous des formes solubles. Deuxièmement, la lyse des cellules doit être complète et la viscosité du lysate doit être minimale. L’inclusion de lysozyme et l’utilisation de trois cycles de gel-dégel sont souvent suffisantes pour lyser complètement les cellules. Cependant, l’ADN chromosomique libéré...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x pin tool	V&P Scientific	VP 404	96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long
96-well V-bottom microtiter plate	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA collection strain	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
gel filtration10x300 column	GE Healthcare	28990944	contains 20% ethanol as preservative
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glycerol 87% for analysis
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP Storage Phosphor Screen	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropyl β-D-thiogalactoside
Lysogeny Broth (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Broth Base
Lysozyme	SIGMA	L4949	from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98%
MgCl2 (Magnesium chloride)	SIGMA	208337
MilliQ water			ultrapure water
multichannel pipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitrocellulose Blotting Membrane	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)	SIGMA	202444
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	SIGMA	93482	Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)
Phosphor-imager	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager
Pipette Tips, filtered	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μl nonsterile
Poly-Prep Chromatography column	Bio-Rad	7311550	polypropylene chromatography column
Protease inhibitor Mini	Pierce	A32955	Tablets, EDTA-free
screw cap tube	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile
SLS 96-deep Well plates	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural
spin column	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base for Molecular Biology
Tween 20	SIGMA	P1379	viscous non-ionic detergent
β-mercaptoethanol	SIGMA	M3148	99% (GC/titration)