Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

Riepilogo

Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.

Abstract

L'ultimo decennio ha visto enormi progressi nella comprensione di piccole molecole di segnalazione nella fisiologia batterica. In particolare, le proteine bersaglio di diversi messaggeri secondari derivati da nucleotidi (NSM) sono state sistematicamente identificate e studiate in organismi modello. Questi risultati sono dovuti principalmente allo sviluppo di diverse nuove tecniche tra cui la tecnica del composto di cattura e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA), che sono state utilizzate per identificare sistematicamente le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questo documento descrive l'uso di NSM, guanosina penta- e tetrafosfati (p)ppGpp, come esempio e dimostrazione video della tecnica DRaCALA. Utilizzando DRaCALA, 9 su 20 note e 12 nuove proteine bersaglio di (p)ppGpp sono state identificate nell'organismo modello, Escherichia coli K-12, dimostrando la potenza di questo test. In linea di principio, DRaCALA potrebbe essere utilizzato per studiare piccoli ligandi che possono essere etichettati da isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. I passaggi critici, i pro e i contro di DRaCALA sono discussi qui per un'ulteriore applicazione di questa tecnica.

Introduzione

I batteri utilizzano diverse piccole molecole di segnalazione per adattarsi ad ambienti in costante cambiamento^1,2. Ad esempio, gli autoindoduttori, i lattoni N-acilomoserina e i loro oligopeptidi modificati, mediano la comunicazione intercellulare tra i batteri per coordinare il comportamento della popolazione, un fenomeno noto come quorum sensing². Un altro gruppo di piccole molecole di segnalazione sono gli NSM, tra cui l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP), il di-AMP ciclico, il monofosfato ciclico di di-guanosina (di-GMP ciclico) e i guanosina penta- e tetra fosfati (p)ppGpp¹. I batteri producono questi NSM come risposta a una varietà di diverse condizioni di stress. Una volta prodotte, queste molecole si legano alle loro proteine bersaglio e regolano diverse vie fisiologiche e metaboliche per far fronte agli stress incontrati e migliorare la sopravvivenza batterica. Pertanto, l'identificazione delle proteine bersaglio è un prerequisito inevitabile per decifrare le funzioni molecolari di queste piccole molecole.

L'ultimo decennio ha visto un boom di conoscenza di queste piccole molecole di segnalazione, principalmente a causa di diverse innovazioni tecniche che hanno svelato le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questi includono la tecnica del composto di cattura^3,4,5e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA)⁶ da discutere in questo articolo.

Inventato da Vincent Lee e colleghi nel 2011^6,DRaCALA utilizza la capacità di una membrana nitrocellulosa di sequestrare in modo differenziale ligandi liberi e legati alle proteine. Molecole come le proteine non possono diffondersi su una membrana nitrocellulosa, mentre piccoli ligandi, come gli NSM, sono in grado di farlo. Mescolando l'NSM(ad esempio,ppGpp) con la proteina da testare e individuandoli sulla membrana, ci si possono aspettare due scenari (Figura 1): Se (p)ppGpp si lega alla proteina, il (p)ppGpp radiomarcato sarà trattenuto al centro dello spot dalla proteina e non si diffonderà verso l'esterno, dando un piccolo punto intenso (cioè., forte segnale radioattivo) sotto un fosforiger. Tuttavia, se (p)ppGpp non si lega alla proteina, si diffonderà liberamente verso l'esterno per produrre una grande macchia con segnale radioattivo di fondo uniforme.

Inoltre, DRaCALA può rilevare l'interazione tra una piccola molecola e una proteina nonpurata in un intero lisi cellulare se la proteina è presente in quantità sufficiente. Questa semplicità consente l'uso di DRaCALA nell'identificazione rapida di bersagli proteici utilizzando una libreria di espressioni ORFeome. Infatti, le proteine bersaglio di cAMP⁷, di-AMP^{ciclico 8}, ciclico di-GMP^9,10e (p) ppGpp^11,12,13 sono state sistematicamente identificate utilizzando DRaCALA. Questo articolo video utilizza (p)ppGpp come esempio per dimostrare e descrivere i passaggi critici e le considerazioni per eseguire uno screening DRaCALA di successo. Da notare, una descrizione più approfondita di DRaCALA¹⁴ è altamente raccomandata da leggere in combinazione con questo articolo prima di eseguire DRaCALA.

Figura 1: Il principio di DRaCALA. (A) Schema del saggio DRaCALA. Vedi il testo per i dettagli. (B) Quantificazione e calcolo della frazione vincolante. Vedi il testo per i dettagli. In breve, le macchie DRaCALA saranno analizzate disegnando due cerchi che circoscrivono l'intero punto e il punto scuro interno(cioèil (p)ppGpp trattenuto a causa del legame della proteina testata). Il segnale di legame specifico è il segnale radioattivo del cerchio interno (S1) dopo aver sottratto il segnale di fondo non specifico (calcolato da A₁ × ((S₂-S₁)/(A₂-A₁))). La frazione di legame è il segnale di legame specifico diviso per il segnale radioattivo totale (S2). Abbreviazioni: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosina penta- e tetrafosfati; RT = temperatura ambiente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

1. Preparazione di lizzati a cellule intere

1. Inoculare i ceppi di raccolta E. coli K-12 ASKA ORFeome¹⁵ in 1,5 mL di brodo di lisogenia (LB) contenente 25 μg/mL di cloramfenicolo in piastre di pozzetti profondi 96 pozzetti. Crescere durante la notte (O/N) per 18 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattosiranoside (IPTG) (0,5 mM finale) alle colture O/N per indurre l'espressione proteica a 30 °C per 6 ore.
2. Celle a pellet a 500 x g per 10 min. Congelare il pellet a -80 °C fino all'uso. Per lisi delle cellule, aggiungere 150 μL di tampone di lisi L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, integrato con 2 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 40 μg / mL DNasi 1 e 0,5 mg / mL lisozima) per sospendare il pellet.
3. Congelare le celle a -80 °C per 30 minuti, quindi scongelare a 37 °C per 20 minuti. Ripeti questo ciclo tre volte per lisi delle cellule. Conservare i lasati a -80 °C prima dell'uso.

2. Purificazione di Rel_seq e GppA

NOTA: Le proteine ricombinanti Rel_seq di Streptococcus equisimilis e GppA di E. coli K-12 sono utilizzate per sintetizzare rispettivamente pppGpp e ppGpp radiomarcati.

1. Crescere e raccogliere cellule sovraesprimendo ogni proteina.
   1. Coltivare il ceppo E. coli BL21 DE3 fino alla fase esponenziale (densità ottica (OD) ~ 0,3-0,4) in brodo LB e girare verso il basso 1 mL di coltura a 6000 x g per 5 minuti. Decantare il surnatante e riconsosciare le cellule con 100 μL di brodo TSB ghiacciato (brodo LB integrato con 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/mL dimetilsolfossido, 20 mM MgCl_2).
   2. Mescolare i plasmidi con il rel_seq e il gppAmarcati con istidina, ciascuno 100 ng, con le sospensioni cellulari di cui sopra in TSB, e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Shock termico delle celle a 42 °C per 40 s. Mettere la miscela su ghiaccio per 2 minuti e aggiungere 1 mL di brodo LB a temperatura ambiente per consentire alle cellule di recuperare per 1 ora a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
   3. Placcare le cellule recuperate su piastre di agar LB integrate con gli antibiotici corrispondenti (Rel_seq:100 μg/mL di ampicillina; GppA: 30 μg/mL kanamicina). Il giorno successivo, inoculare le colonie in brodo LB per iniziare le precolture O/N di entrambi i ceppi a 37 °C.
   4. Dopo 18 ore, inoculare 500 mL di LB medium con 10 mL delle colture O/N e gli antibiotici corrispondenti. Coltivare le colture agitando a 160 giri/min a 37 °C. Quando l'OD_600nm raggiunge 0,5-0,7, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 mM IPTG e crescendo per 3 ore a 30 °C con agitazione a 160 rpm.
   5. Raccogliere le cellule ruotando a 6084 x g per 10 minuti a 4 °C. Riconsegregare il pellet in 20 mL di soluzione salina ghiacciata tamponata con 1x fosfato (PBS) e ricentrizzare a 1912 x g per 20 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e congelare il pellet a -20 °C prima dell'uso.
2. Purificazione dell'affinità dell'acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA)
   NOTA: da questo punto in poi, assicurarsi che i campioni siano freddi.
   1. Aggiungere 40 mL di tampone di lisi ghiacciato L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM imidazolo, 10 mM β-mercaptoetanolo integrato con inibitori della proteasi (compressa senza EDTA; vedere la tabella dei materiali)per sospendare il pellet. Lisi delle celle tramite sonicazione (ampiezza del 60%, 2 s ON / 4 s OFF per 8 min ON). Eliminare il lisito ruotando a 23.426 x g per 40 minuti a 4 °C e continuare con il surnatante per la purificazione.
   2. Durante la centrifugazione di cui sopra, preparare la resina Ni-NTA.
      1. Trasferire 500 μL di resina Ni-NTA omogeneizzata in una colonna di cromatografia in polipropilene in piedi e lasciarla depositare per 15 minuti e la soluzione di stoccaggio sgocciola. Lavare la resina con 15 ml di acqua ultrapura due volte, quindi lavare la colonna con 15 ml del tampone di lisi L2.
   3. Caricare il surnatante eliminato del lisi di cella dal passaggio 1 sulla colonna e lasciarlo scorrere. Lavare la colonna con 30 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 20 mM imidazolo).
   4. Eluire le proteine con 400 μL del tampone di eluizione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 500 mM imidazolo) tre volte. Quindi, ripetere l'eluizione con altri 300 μL del tampone di eluizione. Combinare le proteine eluite ad un volume finale di 700 μL.
3. Filtrazione del gel
   1. Preparare il tampone di filtrazione in gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolo). Lavare la colonna di esclusione delle dimensioni con un volume di colonna (25 ml) del tampone di filtrazione del gel.
   2. Caricare il campione di cui sopra di 700 μL utilizzando un anello da 500 μL, eseguire a 0,5 ml / min e raccogliere 2-3 frazioni, ciascuna di 0,5 mL di volume, contenenti le rispettive proteine.
   3. Combinare e concentrare le frazioni contenenti ciascuna delle proteine utilizzando una colonna di spin e misurare la concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford.

3. Sintesi di ³²pppGpp e ppGpp con etichetta P

1. Assemblare una reazione Rel_seq su piccola scala in un tubo con tappo a vite (vedere Tabella 1).
   NOTA: Lavorare con reagenti radioattivi solo in un luogo autorizzato e con dispositivi di protezione individuale.

	Volume (μL)
	Piccola scala	Grande scala
Acqua ultrapura
10x Relseq buffer*	2	50
ATP (8 mM finale)
Relseq (4 μM finale)
32 anni P-α-Guanosina trifosfato (GTP) (finale 120 nM) (ATTENZIONE)	0.2	5
totale	20	500

Tabella 1: Informazioni di assemblaggio per le reazioni di sintesi su piccola e grande scala di ³²pppGpp con etichetta P. *10x tampone Relseq contiene 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abbreviazione: pppGpp = guanosina pentafosfato.

2. Incubare il tubo a 37 °C in un bimbyxer per 1 ora, poi a 95 °C per 5 minuti e metterlo sul ghiaccio per 5 minuti. Abbassare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato ³²P-pppGpp) in un nuovo tubo a vite.
3. Per sintetizzare ³²P-ppGpp da ³²P-pppGpp, trasferire metà del prodotto ³²p-pppGpp in un nuovo tubo con tappo a vite e aggiungere 1 μM GppA. Incubare il tubo a 37 °C per 10 minuti, a 95 °C per 5 minuti, quindi posizionare sul ghiaccio per 5 minuti.
4. Abbassare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato ³²P-ppGpp) in un nuovo tubo a vite.
5. Analizzare i ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp eseguendo 1 μL dei campioni su una piastra di cromatografia a strato sottile (TLC di cellulosa modificata da polietileneimina) utilizzando il 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, come fase mobile.
   NOTA: Utilizzare il guanosina 5'-trifosfato con etichetta^α-32P⁽³²P-α-GTP) come controllo.
6. Asciugare completamente la piastra TLC, posizionarla tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo al fosforo per 5 minuti. Visualizza e quantifica i segnali utilizzando un fosforimmager.
   NOTA: Quando i rapporti di ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp sono superiori all'85%, una reazione su larga scala (500 μL, sufficiente per lo screening di 20 piastre a 96 pozzetti) potrebbe essere assemblata e sintetizzata utilizzando la Tabella 1.

4. Screening DRaCALA delle proteine bersaglio di (p)ppGpp

1. Scongelare e trasferire 20 μL di lizzati a cellule intere in una piastra microtitolato a V a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 U/well di endonucleasi da Serratia marcescense incubare a 37 °C per 15 minuti per ridurre la viscosità del lsato. Mettere i lasati sul ghiaccio per 20 min.
2. Mescolare i ³²P-pppGpp e ^{i 32}P-ppGpp in un rapporto 1:1 e aggiungere 1x tampone di lisi L1 per rendere la concentrazione finale di (p)ppGpp pari a 4 nM.
   NOTA: Data la somiglianza chimica tra pppGpp e ppGpp, un mix di entrambe le sostanze chimiche semplificherà il processo di screening.
3. Utilizzare una pipetta multicanale e punte di pipetta filtrate per aggiungere e miscelare 10 μL della miscela (p)ppGpp con il l'alleato cellulare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
4. Lavare lo strumento a 96 x pin inserendo una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 s e asciugare su carta velina per 30 s. Ripetere il lavaggio dello strumento pin 3x.
5. Posizionare lo strumento pin nelle piastre campione a 96 pozzetti sopra e attendere 30 s. Sollevare l'utensile pin verso l'alto e posizionarlo direttamente su una membrana di nitrocellulosa per 30 s.
   NOTA: se manca un punto, individuare 2 μL dei campioni corrispondenti con una pipetta e punte filtrate. Si consiglia di creare un punto duplicato dello stesso campione come indicato di seguito.
6. Asciugare la membrana per 5 minuti a RT. Posizionare la membrana tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo di fosforo di stoccaggio per 5 minuti. Visualizza utilizzando un fosforiger.

5. Quantificazione e identificazione di potenziali proteine bersaglio

1. Utilizzare il software di analisi associato al phosphorimager per aprire il file .gel delle piastre visualizzate. Utilizzare la funzione di analisi array per definire i 96 punti impostando una griglia di 12 colonne x 8 righe.
2. Definite grandi cerchi per circoscrivere il bordo esterno dell'intero punto (consultate la Figura 1B). Esporta Volumn+Sfondo e Area dei cerchi grandi definiti e salva in un foglio di calcolo.
   NOTA: se necessario, riposizionare ogni singolo cerchio in modo che si sovrapponga perfettamente ai punti e ridimensionare ogni singolo cerchio per renderlo leggermente più grande del punto effettivo.
3. Ridimensiona i cerchi definiti per circoscrivere i piccoli punti interni. Esportare Volumn+Sfondoe Area dei piccoli cerchi definiti e salvarli in un foglio di calcolo.
4. Calcolare le frazioni di associazione nel foglio di calcolo utilizzando l'equazione nella Figura 1Be tracciare i dati. Identificare le potenziali proteine leganti nei pozzi che mostrano elevate frazioni di legame rispetto alla maggior parte degli altri pozzi.

Figura 2: Flusso di lavoro complessivo del processo di screening DRaCALA. La produzione di proteine da una raccolta di Escherichia coli ASKA è indotta e le cellule vengono lizzate. Nel frattempo, le proteine ricombinanti Rel_seq-His e GppA-His sono purificate e utilizzate per sintetizzare ³²pppGpp e ppGpp etichettati con P da ³²P-α-GTP. Le molecole (p)ppGpp etichettate radioattivamente vengono quindi mescolate con i lisati e uno strumento a 96 pin viene utilizzato per individuare le miscele su una membrana di nitrocellulosa per la successiva esposizione a uno schermo di stoccaggio del fosforo, imaging e quantificazione dei segnali radioattivi. Abbreviazioni: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosina penta- e tetrafosfati; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropil β-d-1-tiogalatopiranoside; GTP = guanosina 5'-trifosfato; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di dodecilsolfato-poliacrilammide di sodio; TLC = cromatografia su strato sottile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Seguendo il protocollo sopra descritto si produrranno in genere due tipi di risultati (Figura 3).

La Figura 3A mostra una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi (frazioni di legame < 0,025) dalla maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo dal pozzo H3 dà una frazione di legame di ~0,35 che è molto più alta di quella osservata per gli altri pozzi. Anche senza quantificazione, beh H3 è notevole, sugge...

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Discussione

Uno dei passaggi critici nell'esecuzione dello screening DRaCALA è quello di ottenere buoni lasati a cellule intere. In primo luogo, le proteine testate dovrebbero essere prodotte in grandi quantità e in forme solubili. In secondo luogo, la lisi delle cellule dovrebbe essere completa e la viscosità del lizzate deve essere minima. L'inclusione del lisozima e l'uso di tre cicli di congelamento-disgelo sono spesso sufficienti per far lisi completamente le cellule. Tuttavia, il DNA cromosomico rilasciato rende viscoso il ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x pin tool	V&P Scientific	VP 404	96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long
96-well V-bottom microtiter plate	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA collection strain	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006	Reagent Concentrate
DMSO	SIGMA	D8418	≥99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
gel filtration10x300 column	GE Healthcare	28990944	contains 20% ethanol as preservative
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1214	Glycerol 87% for analysis
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP Storage Phosphor Screen	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropyl β-D-thiogalactoside
Lysogeny Broth (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Broth Base
Lysozyme	SIGMA	L4949	from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98%
MgCl2 (Magnesium chloride)	SIGMA	208337
MilliQ water			ultrapure water
multichannel pipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitrocellulose Blotting Membrane	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)	SIGMA	202444
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	SIGMA	93482	Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)
Phosphor-imager	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager
Pipette Tips, filtered	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μl nonsterile
Poly-Prep Chromatography column	Bio-Rad	7311550	polypropylene chromatography column
Protease inhibitor Mini	Pierce	A32955	Tablets, EDTA-free
screw cap tube	Thermo Scientific	3488	Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile
SLS 96-deep Well plates	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural
spin column	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base for Molecular Biology
Tween 20	SIGMA	P1379	viscous non-ionic detergent
β-mercaptoethanol	SIGMA	M3148	99% (GC/titration)