白细胞消除过滤器衍生的CD34 +细胞作为研究巨核细胞分化和血小板形成的细胞来源

摘要

该协议详细描述了获得白细胞衍生的CD34 +造血祖细胞及其 体外 分化和成熟为能够释放培养基中血小板的含丙酸盐的巨核细胞所涉及的所有步骤。该程序可用于深入分析控制巨核细胞生成的细胞和分子机制。

摘要

人造血祖细胞 的体外 扩增和分化为能够伸长丙酸盐和释放血小板的巨核细胞，可以深入研究血小板生物发生的机制。现有的培养方案主要基于来自骨髓或脐带血的造血祖细胞，这引发了许多伦理、技术和经济问题。如果已经有可用的方案可以从外周血中获取CD34细胞，那么本手稿提出了一种简单而优化的方案，用于从血液中心现成的白细胞消除过滤器中获取CD34 +细胞。这些细胞是从白细胞破灭过滤器中分离出来的，用于制备输血产品，相当于八次献血。这些过滤器应该被丢弃。描述了从这些过滤器中收集鉴定为CD34 +细胞的造血祖细胞的详细程序。还详细介绍了在讨论其表型进化的同时获得延伸丙酸盐的成熟巨核细胞的方法。最后，该协议提出了一种经过校准的移液方法，以有效地释放在形态学和功能上与天然血小板相似的血小板。该协议可以作为评估在过程的各个步骤中起作用的药理学化合物的基础，以剖析潜在的机制并接近 体内 血小板产量。

引言

血小板来自专门的大多倍体细胞，即巨核细胞（MK），其起源于称为巨核细胞（MKP）的恒定和微调的生产过程。该过程的顶点是造血干细胞，它们与骨髓环境（细胞因子，转录因子，造血龛）接触，将能够增殖并分化成能够致力于巨核细胞通路的造血祖细胞（HP），从而产生未成熟的MKs^1。在各种细胞因子的影响下，特别是血小板生成素（TPO），这是MKP的主要细胞因子;然后，MK将经历两个主要的成熟阶段:内膜分裂和分界膜（DMS）的发展。然后，这种完全成熟的MK出现在正弦血管附近，在该血管中它可以发射细胞质延伸，即丙酸盐，其将在血流下释放并随后重塑为功能性血小板²。1994年TPO的克隆³ 通过加速体 外 培养技术的发展，促进了HP分化和MK成熟的MKP研究。

有许多影响血小板的病理，无论是在血小板数量（增加或减少）和功能^方面4，5。能够从人类HP体外概括MKP可以提高对这一过程背后的分子和细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。

各种来源的人HP是合适的:脐带血，骨髓和外周血^6，7，8。与从脐带血或骨髓中恢复相比，从外周血中采集HP引起的后勤和伦理问题更少。HP可以从白细胞分离术或黄褐色外套中恢复，但这些来源很昂贵，并且在血液中心并不总是可用的。其他方案，更便宜，更容易执行，允许直接回收人外周血单核细胞（PBMC），而无需事先CD34驱动的分离^4，8。然而，这种方法对巨核细胞的纯度并不令人满意，建议从PBMC中选择CD34 +细胞以最佳分化为MK。这导致我们从白细胞还原过滤器（LRF）中实施了HP纯化，该过滤器通常用于血库中以去除白细胞，从而避免不良免疫反应⁹。事实上，自1998年以来，法国的血小板浓缩物已被自动白细胞化。在此过程结束时，LRF被丢弃，所有保留在LRF中的细胞都被破坏。因此，LRF中的细胞很容易获得，无需额外费用。LRF具有接近白细胞分离术或黄褐色外套获得的细胞含量，特别是其CD34 + HP的组成使它们成为非常有吸引力的来源¹⁰。LRF作为人类HP来源已被证明可以为细胞提供完整的功能容量¹¹。这种来源的优点是丰富且价格合理，可用于实验室研究。在此背景下，本文依次描述了:i）从LRF中提取和选择CD34⁺ HP;ii）两阶段优化培养，其概括了HP对巨核细胞途径的承诺以及能够释放丙酸盐的MK的成熟;iii）从这些MK中有效释放血小板的方法;和iv）表型MK和培养血小板的程序。

研究方案

对照组的人体样本是从自愿献血者那里获得的，他们给予了由进行研究的输血中心（Etablissement Français du Sang-Grand Est）招募的书面知情同意书。所有程序均由法国高等教育和研究部注册和批准，并以AC_2015_2371号注册，捐赠者在CODHECO编号AC-2008 - 562同意书中给予批准，以便将样品用于研究目的。根据赫尔辛基宣言进行了人体研究。

1. 从LRF中提取和选择CD34 +细胞（HP）

1. 试剂的制备 （用于一个LRF）
   1. 准备25 mL过滤洗脱缓冲液:21.25 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），2.5 mL酸性柠檬酸盐葡萄糖（ACD）和1.25 mL分解胎牛血清（FBS）。过滤0.22μm，置于37°C。
   2. 准备500毫升PBS和2毫升乙二胺四乙酸（EDTA）。
   3. 将 25 mL 密度梯度培养基 （DGM） （1.077 g/mL） 放入两个 50 mL 管中。
2. LRF反冲洗模式（图1）
   注意:此步骤需要无菌管焊接机，允许无菌连接热塑性管道。
   1. 首先，将LRF连接到空的600 mL转运袋，将LRF连接到管路组（图1A）。在生物安全柜下，将与处理的LRF数量相对应的过滤和制备的洗脱缓冲液的总体积（xLRF x 25 mL）注入空袋中。然后，使用30 mL注射器通过LRF轻轻抽吸袋的全部内容物，反冲洗并将细胞转移到新的50 mL管中（图1B）。
   2. 对红细胞沉降，用葡聚糖2%稀释细胞悬浮液一半，充分混合以聚集红细胞。在室温（RT）下等待30分钟。

图1:LRF反冲洗方式（A）代表方案（i）将转运袋与LRF无菌连接，以及（ii）将管道设置到LRF。（B）用于细胞收集的注射器连接的代表性方案。请点击此处查看此图的放大版本。

3. PBMC 收集
   1. 红细胞沉降后，取出上清液并将其转移到50 mL管中，并用PBS-EDTA 2 mM填充。将上清液轻轻覆盖到上述制备的DGM上。让上清液轻轻流动，而不会破坏密度梯度的表面平面。在关闭制动模式下，在室温下以400 x g 离心30分钟。
   2. 使用一次性转印移液器收集PBMC层。将细胞从每个DGM管转移到新的无菌50 mL管中。用PBS-EDTA 2 mM填充每个管，并在50 mL PBS-EDTA 2 mM中以200 x g 在室温下在制动模式下洗涤两次10分钟。
   3. 移液并用50 mL PBS-EDTA 2 mM移液细胞沉淀。
      注意:可以通过在夜间将收集的细胞保持在4°C的搅拌下来停止该过程。然后，用40μm细胞过滤器过滤悬浮液以除去形成的聚集体。
4. CD34+细胞选择
   1. 确定细胞数，并在室温下以400×g离心10分钟，然后打开。
   2. 完全吸出上清液，并重悬于CD34选择试剂盒制造商详细介绍的适当体积的PBS-EDTA 2 mM中（300μLPBS-EDTA用于10^个8 个细胞）。加入FcR封闭试剂和CD34微珠，浓度适当（50μL，10⁸ 个细胞）。
   3. 在4°C下30分钟后，洗涤细胞悬浮液并重悬于CD34选择试剂盒制造商详细描述的适当体积的PBS-EDTA 2mM（每10^个8 个细胞500μL）。
      注意:选择是在排序列上进行的，每列最多通过2 x 10⁹ 个单元格。
   4. 将样品传递到磁铁的湿柱上。用3 mL PBS-EDTA 2 mM洗涤两次，并用5 mL PBS-EDTA 2 mM洗脱细胞。为了提高样品的纯度，有必要按照相同的程序在新色谱柱上进行第二次运行。
      注:预期数量为6.1 x 10⁵ 个电池/LRF（图2A）。对于较高的 LRF 值，请相应地放大试剂和方法。
5. 评估CD34+细胞纯度
   1. 加入CD34⁺ 选择后获得的100μL悬浮液等分试样，2μL人CD34-PE抗体或2μLIgG - PE（对照）。充分混合并在4°C下孵育15分钟。
   2. 通过加入2mL PBS洗涤细胞，并以400×g离心5分钟。 完全吸出上清液并重悬于200μLPBS中。
   3. 通过流式细胞术分析纯度， 如图2A 所示，并在 讨论中。
      注:预计CD34+细胞的纯度高于90%（图2Bii）。
   4. 直接使用CD34 +细胞或冷冻以进一步使用。
6. CD34+细胞冷冻
   注意:CD34 +细胞冷冻以每毫升10⁶ 个细胞的密度进行。
   1. 在CD34 +细胞数测定后，准备以下冷冻保存培养基:（1）60%Stemspan + 40%FBS，（2）40%Stemspan + 40%FBS + 20%二甲基亚砜（DMSO）并允许在4°C下冷却。
   2. 将CD34 +细胞在室温下以400×g离心5分钟，并将沉淀重悬于冷溶液1中，然后立即加入冷溶液2（v / v）。
   3. 立即将冷冻管放入-80°C冰箱24小时，然后将冷冻管转移到液氮罐中。

2. CD34+细胞的培养和分化，生成成熟的含丙酸盐巨核细胞

注:细胞培养方案（图3A），细胞培养程序的代表性方案详见本节。

1. CD34+细胞解冻（如果需要）
   1. 准备解冻溶液:13 mL PBS-20%FBS，置于37°C下15分钟。快速将冷冻管转移到37°C的水浴中，直到只有一个小冰晶。在生物培养柜下，移取整个内容物，并缓慢转移13mL预热解冻溶液。
   2. 确定细胞数量和细胞活力。
2. 培养方案，步骤1:从第0天到第7天
   注意:通常在24孔板中培养物，每孔1mL培养基，密度为40，000个活细胞/ mL，相当于20，000个活细胞/ cm²。如果计划进行任何放大生产，则遵守此密度至关重要。
   1. 生长培养基制备 :在无血清造血细胞扩增培养基（先前加热至37°C）中，加入青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）1x，人低密度脂蛋白（hLDL）在20μg/ mL，巨核细胞扩增1x的细胞因子混合物和1μM的茎仁素1（SR1）。
   2. 细胞接种 :在室温下以400×g离心解冻的CD34 +细胞5分钟。彻底除去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL培养基中，并进行细胞计数和活力，以确定接种细胞的适当体积。
   3. 将细胞在室温下离心 400×g5 分钟，并将沉淀重悬于适当体积的温生长培养基中。将细胞在37°C下用5%CO₂ 孵育7天。
3. 培养方案，步骤2:从第7天到第13天（图3B，第13天的代表性图像）
   注意:培养物通常在24孔板中制成，每孔1mL培养基，密度为50，000个活细胞/ mL，相当于25，000个活细胞/ cm²。如果计划进行任何放大生产，则遵守此密度至关重要。
   1. 成熟培养基制备:在无血清造血细胞扩增培养基（先前加热至37°C）中，加入PSG 1x，hLDL在20μg/ mL，TPO在50ng / mL，SR1在1μM。
   2. 在显微镜下检查细胞。在第7天，细胞通过填充孔或烧瓶而不太融合而表现出圆形和均匀的外观。
   3. 在生物安全柜下，轻轻地将细胞转移到15 mL管中。用PBS清洗井。然后，确定细胞的数量及其存活能力，以计算出接种细胞的适当体积。
   4. 在室温下以400×g离心细胞5分钟。除去上清液并将细胞重悬于上一步计算的适当体积的温培养基中。将细胞在37°C，5%CO₂下孵育6天。
4. 第13天培养的血小板释放
   1. 向培养物中加入0.5μM前列腺素I_{2（PGI 2）} 和0.02 U / mL吡喃酶，并用1 mL移液器进行连续移液5次。
      注意:血小板现在被释放到培养基中。

3. 流式细胞术分析（MK表型和培养血小板计数）

注意:该协议可以应用于所选培养日的细胞表型。它还允许测定培养的血小板释放的数量（图4A，B）。

1. MK 分析的准备工作
   1. 按如下方式标记四组微量离心管:未标记的细胞作为对照，细胞+ 5μL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞+ 5μL CD34 - PECy7，细胞+ 5μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5μL CD34 - PECy7。每管至少使用1.10^个5 个细胞，每管不超过1.10^个6 个细胞。加入到每个细胞术管和不同抗体的100μL细胞悬浮液中。在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
   2. 然后，每管加入2毫升PBS-EDTA 2 mM，并在室温下以400×g离心5分钟。在离心过程中，制备PBS-EDTA 2mM + 7-氨基放线菌素-D（7AAD）（1/100）的溶液，每管允许300μL溶液。
   3. 除去上清液，在300μLPBS-EDTA 2 mM和7AAD中取出沉淀。在30分钟内通过流式细胞仪运行样品。
      注:流式细胞术的分析策略如图 3C 所示，并在 讨论中显示。
2. 用于培养血小板分析的试管制备
   1. 按如下方式标记四组微量离心管:未标记的细胞作为对照，细胞+ 5μL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞+ 20μL CD42a - PE，细胞+ 5μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20μL CD42a - PE。在培养孔中连续移液五次后，将300μL悬浮液转移到管中进行细胞术，其中包含校准数量的荧光珠。
   2. 加入抗体，在室温下在黑暗中孵育30分钟。
   3. 在30分钟内通过流式细胞仪运行样品，并设置采集以通过5，000个微珠。
      注:流式细胞术的分析策略如图 4B 所示，并在 讨论中显示。

结果

从LRF中提取和选择CD34 +细胞
在这里，该方法源自Peytour等人^9，描述了从白细胞去除后血库中可用的废弃LRF中提取和选择CD34⁺细胞。在反冲洗程序之后，通常恢复1.03 x 10 9±2.45 x^{10 8}个细胞/ LRF（平均值±SEM; n = 155），存活率为94.88±0.10%（图2A i）。在CD34阳性选择后，获得平均615.54×10 3±12.28个细胞/LRF（n = 155）?...

讨论

该协议描述了一种生产MK的方法，该MK能够从血液衍生的HP中释放丙酸盐并从培养基中释放血小板。HP从LRF（血库的副产品）中获得，用于从细胞血液制品中去除污染的白细胞并避免不良反应。虽然这种方法相对简单，但有几点值得特别注意。

必须轻柔地在密度梯度培养基上沉积细胞悬浮液（步骤1.3.1）以避免混合（红色含量）。如果未仔细执行此步骤，则协议应在此点停止。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material