Клетки CD34+ из лейкополетных фильтров как источник клеток для изучения дифференцировки мегакариоцитов и образования тромбоцитов

Резюме

Этот протокол подробно описывает все этапы, связанные с получением гемопоэтических прародителей CD34+ на основе лейкофильтра и их дифференцировкой in vitro и созреванием в проплателетоносные мегакариоциты, способные высвобождать тромбоциты в культуральная среда. Эта процедура полезна для углубленного анализа клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих мегакариопоезис.

Аннотация

Расширение in vitro и дифференциация кроветворных прародителей человека в мегакариоциты, способные удлинивать проplatelets и высвобождать тромбоциты, позволяет углубленно изучить механизмы, лежащие в основе биогенеза тромбоцитов. Доступные протоколы культивирования в основном основаны на кроветворных прародителях, полученных из костного мозга или пуповинной крови, что вызывает ряд этических, технических и экономических проблем. Если уже существуют доступные протоколы получения КЛЕТОК CD34 из периферической крови, эта рукопись предлагает простой и оптимизированный протокол для получения клеток CD34+ из фильтров лейкодесопощения, легко доступных в центрах крови. Эти клетки выделяют из лейкодеплеционных фильтров, используемых при приготовлении продуктов переливания крови, соответствующих восьми донорствам крови. Эти фильтры предназначены для удаления. Описана подробная процедура сбора гемопоэтических прародителей, идентифицированных как клетки CD34+, из этих фильтров. Также подробно описан способ получения зрелых мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты при обсуждении их фенотипической эволюции. Наконец, протокол представляет собой калиброванный метод пипетирования для эффективного высвобождения тромбоцитов, которые морфологически и функционально похожи на нативные. Этот протокол может служить основой для оценки фармакологических соединений, действующих на различных этапах процесса, для препарирования основных механизмов и приближения к выходу тромбоцитов in vivo.

Введение

Тромбоциты крови происходят из специализированных крупных полиплоидных клеток, мегакариоцитов (МК), которые происходят из постоянного и тонко настроенного производственного процесса, известного как мегакариопоезис (MKP). На вершине этого процесса находятся гемопоэтические стволовые клетки, которые при контакте с средой костного мозга (цитокины, факторы транскрипции, кроветворная ниша) смогут размножаться и дифференцироваться в кроветворные прародители (НР), способные фиксироваться в направлении мегакариоцитного пути, давая начало незрелым МК^1. Под влиянием различных цитокинов, и в частности тромбопоэтина (ТПО), который является основным цитокином МКФ; Затем МК пройдет две основные стадии созревания: эндомитоз и развитие демаркационных мембран (ДМС). Этот полностью зрелый МК затем появляется близко к синусоидальному сосуду, в котором он может испускать цитоплазматические расширения, проplatelets, которые будут высвобождаться под кровотоком и впоследствии реконструироваться в функциональные тромбоциты^2. Клонирование ТПО в 1994^г.3 обеспечило импульс в изучении МКП за счет ускорения разработки методов культивирования in vitro, позволяющих дифференцировать НР и созревание МК.

Существует множество патологий, поражающих тромбоциты крови, как по количеству тромбоцитов (увеличение или уменьшение), так и по функции^4,5. Возможность рекапитулировать MKP in vitro от человеческой HP может улучшить понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе этого процесса и, в конечном счете, терапевтического ведения пациентов.

Подойдут различные источники НР человека: пуповинная кровь, костный мозг, периферическая кровь^6,7,8. Сбор HP из периферической крови вызывает меньше логистических и этических проблем, чем их восстановление из пуповинной крови или костного мозга. ГП можно восстановить после лейкафереза или пышной шерсти, но эти источники дороги и не всегда доступны в центрах крови. Другие протоколы, менее дорогие и простые в выполнении, позволяют напрямую восстанавливать мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) без необходимости предварительной изоляции CD34^4,8. Однако чистота мегакариоцитов не является удовлетворительной при этом методе, и для оптимальной дифференцировки в МК рекомендуется отбор клеток CD34+ из PBMC. Это привело нас к внедрению очистки HP от фильтров лейкоредукции (LRF), обычно используемых в банках крови для удаления белых кровяных клеток и, таким образом, предотвращения неблагоприятных иммунологических реакций^9. Действительно, с 1998 года концентраты тромбоцитов автоматически лейкодеплируются во Франции. В конце этого процесса LRF выбрасываются, и все клетки, оставшиеся в LRF, разрушаются. Таким образом, ячейки в LRF легко доступны без каких-либо дополнительных затрат. LRF имеют клеточное содержание, близкое к тому, которое получено путем лейкафереза или в пушистых слоях, особенно в их составе CD34 + HP, что делает их удивительно привлекательным источником^10. Уже было продемонстрировано, что LRF как человеческий источник HP обеспечивает клетки с неповрежденными функциональными способностями^11. Этот источник имеет то преимущество, что он обильен и доступен для лабораторных исследований. В этом контексте в данной статье последовательно описываются: i) извлечение и выбор CD34⁺ HP из LRF; ii) двухфазная оптимизированная культура, которая рекапитулирует приверженность HP в мегакариоцитарный путь и созревание MK, способного испускать проплацелеты; iii) способ эффективного высвобождения тромбоцитов из этих МК; и iv) процедура фенотипирования МК и культивированных тромбоцитов.

протокол

Контрольные образцы человека были получены от доноров крови, которые дали письменное информированное согласие, полученное центром переливания крови, где проводилось исследование (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Все процедуры были зарегистрированы и одобрены Министерством высшего образования и исследований Франции и зарегистрированы под номером AC_2015_2371.Доноры дали свое одобрение в форме согласия CODHECO No AC- 2008 - 562, чтобы образцы использовались в исследовательских целях. Исследования на людях проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Извлечение и отбор клеток CD34+ (HP) из LRF

1. Препарат реагента (для одного LRF)
   1. Приготовьте 25 мл фильтрованного буфера элюации: 21,25 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), 2,5 мл кислотно-цитрат-декстрозы (ACD) и 1,25 мл декомплементированной фетальной бытовой сыворотки (FBS). Фильтровать на 0,22 мкм и размещать при 37 °C.
   2. Приготовьте 500 мл PBS с 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
   3. Утилизируйте 25 мл среды градиента плотности (DGM) (1,077 г/мл) в двух пробирках по 50 мл.
2. Методы обратной промывки LRF (Рисунок 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа требуется стерильный аппарат для сварки труб, позволяющий стерильное соединение термопластичных трубок.
   1. Во-первых, подключите LRF к пустому мешку для переноса 600 мл, а LRF к комплекту труб(рисунок 1A). Под шкаф биобезопасности вводят в пустой мешок общий объем отфильтрованного и подготовленного элюирующего буфера, соответствующего количеству обрабатываемых LRF (xLRF x 25 мл). Затем, используя шприц объемом 30 мл, мягко аспирировать все содержимое мешочка через LRF, продуть обратно и перенести клетки в новую трубку объемом 50 мл(рисунок 1B).
   2. Для осаждения эритроцитов разбавьте клеточную суспензию пополам декстраном на 2% и хорошо перемешайте для агрегирования эритроцитов. Подождите 30 мин при комнатной температуре (RT).

Рисунок 1:Условия обратной промывки LRF. (A)Репрезентативная схема(i)стерильного соединения передаточного мешка с LRF и(ii)трубки, установленной на LRF. (B) Репрезентативная схема подключения шприцев для клеточного сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Коллекция PBMC
   1. После осаждения эритроцитов удалите и перенесите супернатант в пробирку 50 мл и заполните ее PBS-EDTA 2 мМ. Аккуратно наложим супернатант на вышеприготовленный ДГМ. Пусть супернатант течет мягко, не нарушая поверхностную плоскость градиента плотности. Центрифуга при 400 х г при RT в течение 30 мин в режиме выключения тормоза.
   2. Соберите слой PBMC с помощью одноразовой трансферной пипетки. Перенесите клетки из каждой трубки DGM в новую стерильную трубку 50 мл. Заполните каждую трубку PBS-EDTA 2 мМ и дважды промыть в 50 мл PBS-EDTA 2 мМ при 200 х г в течение 10 мин при RT в режиме торможения.
   3. Пипетка отключите и объедините гранулу ячейки с 50 мл PBS-EDTA 2 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует возможность остановить процедуру, поддерживая собранные клетки при перемешивании при 4 °C в течение ночи. Затем отфильтруйте суспензию с помощью клеточного ситечкового фильтра 40 мкм, чтобы удалить образовавшемся заполнитель.
4. Выбор ячеек CD34+
   1. Определяют номер ячейки и центрифугу при 400 х г при комнатной температуре в течение 10 мин с включенной паузой.
   2. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (300 мкл PBS-EDTA на 10⁸ ячеек). Добавьте блокирующий FcR реагент и микрограницы CD34 в соответствующей концентрации (50 мкл на 10⁸ клеток).
   3. Через 30 мин при 4 °C промыть клеточную суспензию и повторно суспендировали в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (500 мкл на 10⁸ ячеек).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор производится на сортировке столбцов для прохождения максимум 2 x 10⁹ ячеек на столбец.
   4. Пропустите образец над мокрым столбом магнита. Дважды промыть 3 мл PBS-EDTA 2 мМ и элюлируем клетки 5 мл PBS-EDTA 2 мМ. Второй прогона на новой колонке после той же процедуры необходим для повышения чистоты образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое число 6,1 х 10⁵ ячеек/LRF(рисунок 2A). Для более высоких чисел LRF масштабируйте реагенты и методы соответственно.
5. Оценка чистоты клеток CD34+
   1. Добавьте к аликвоте 100 мкл суспензии, полученной после^cd34+ селекции, 2 мкл человеческого CD34-PE антитела или 2 мкл IgG-PE (контроль). Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
   2. Промывайте ячейки, добавляя 2 мл PBS и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин. Аспират супернатант полностью и повторно суспендируется в 200 мкл PBS.
   3. Проанализируйте чистоту с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 2А и в обсуждении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается чистота клеток CD34+ выше 90%(рисунок 2Bii).
   4. Используйте клетки CD34+ напрямую или заморозьте для дальнейшего использования.
6. Замораживание клеток CD34+
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание клеток CD34+ производится при плотности 10⁶ клеток в мл.
   1. После определения количества клеток CD34+ подготовьте следующие криоконсервационные среды: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) и позвольте охладить при 4 °C.
   2. Центрифугируют ячейки CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в холодном растворе 1, а затем сразу добавляют в холодный раствор 2 (v/v).
   3. Поместите криотрубки непосредственно в морозильную камеру при -80 °C в течение 24 ч, а затем переложите криотрубки в резервуар для жидкого азота.

2. Культивация и дифференцировка клеток CD34+ для получения зрелых проплателет-несущих мегакариоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол клеточной культуры(рисунок 3A),репрезентативная схема процедуры клеточной культуры подробно описаны в этом разделе.

1. Оттаивание клеток CD34+ (при необходимости)
   1. Готовят раствор для размораживания: 13 мл PBS-20% FBS и помещают при 37 °C в течение 15 мин. Быстро перенесите криотрубы на водяную баню с 37 °C до одного маленького кристалла льда. Под биологический культурологический шкаф пипетку выкладываем все содержимое и медленно перекладываем в 13 мл предварительно выморохивающего оттаивающего раствора.
   2. Определите количество клеток и жизнеспособность клеток.
2. Протокол культивной культуры, шаг 1: с 0-го дня по 7-й день
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 40 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 20 000 жизнеспособных^{клеток/см2.} Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.
   1. Препарат питательной среды: В свободные от сыворотки среды расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретые до 37 °C) добавляют пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG) 1x, липопротеин низкой плотности человека (hLDL) при 20 мкг/мл, цитокиновый коктейль расширения мегакариоцитов 1x и stemregenin 1 (SR1) при 1 мкм.
   2. Посев клеток: Центрифугирование размороженных клеток CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Тщательно удаляют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл культурального носителя и выполняют нумерацию и жизнеспособность клеток для определения соответствующего объема для засева клеток.
   3. Центрифугируют ячейки 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в соответствующем объеме теплой питательной среды. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO₂ в течение 7 дней.
3. Протокол культивной культуры, шаг 2: с 7-го по 13-й день(рисунок 3В,репрезентативные изображения на 13-й день)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 50 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 25 000 жизнеспособных клеток/см². Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.
   1. Приготовление среды созревания: В свободной от сыворотки среде расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретой до 37 °C) добавляют PSG 1x, hLDL при 20 мкг/мл, TPO при 50 нг/мл и SR1 при 1 мкМ.
   2. Исследуйте клетки под микроскопом. На 7-й день клетки демонстрируют круглый и однородный вид, заполняя колодцы или колбы, не будучи слишком слишком слизыми.
   3. Под шкафом биобезопасности аккуратно перенесите клетки в пробирку 15 мл. Промывайте колодцы с PBS. Затем определите количество клеток и их жизнеспособность, чтобы рассчитать соответствующий объем для посева клеток.
   4. Центрифугировать ячейки при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируете ячейки в соответствующем объеме теплой среды, рассчитанном на предыдущем этапе. Инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO₂ в течение 6 дней.
4. Высвобождение культивированных тромбоцитов на 13-й день
   1. Добавьте к культуре 0,5 мкМ простагландина I₂ (PGI₂₎ и 0,02 Ед/мл апиразы и выполните последовательную пипетку пять раз пипеткой 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты теперь высвобождаются в среду.

3. Анализ проточной цитометрии (фенотипирование МК и количество культивированных тромбоцитов)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к фенотипированием клеток в выбранные дни культивирования. Он также позволяет определить количество культивированного высвобождения тромбоцитов(рисунок 4A,B).

1. Подготовка к анализу МК
   1. Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 5 мкл CD34 - PECy7, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 мкл CD34 - PECy7. Используйте минимум 1,10⁵ клеток на трубку, не превышайте 1,10⁶ клеток на трубку. Добавьте к 100 мкл клеточной суспензии на цитометрическую трубку и различные антитела. Инкубировать в темноте в течение 30 мин при 4 °C.
   2. Затем добавляют 2 мл PBS-EDTA 2 мМ на пробирку и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Во время центрифугирования готовят раствор PBS-EDTA 2 мМ + 7-Аминоактиномицин-D (7AAD) (1/100), дают по 300 мкл раствора на пробирку.
   3. Удалите супернатант и возьмите гранулу в 300 мкл PBS-EDTA 2 мМ с 7AAD. Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 3C и в обсуждении.
2. Подготовка пробирки для анализа тромбоцитов
   1. Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 20 мкл CD42a - ПЭ, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 мкл CD42a - ПЭ. После пяти последовательных пипеток в культуре скважины переложите 300 мкл суспензии в трубку для цитометрии, содержащую калиброванное количество флуоресцентных шариков.
   2. Добавьте антитела и инкубируют в темноте при RT в течение 30 мин.
   3. Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут и установите комплектование на прохождение 5000 бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 4B и в обсуждении.

Результаты

Извлечение и отбор клеток CD34+ из LRF
Здесь способ, полученный из Peytour et al.^9,описывает экстракцию и отбор CD34⁺ клеток из выброшенных LRF, доступных в банках крови после удаления лейкоцитов. После процедуры обратной проливки обычно восстанавливается 1,03^{x 10 9} ± 2,...

Обсуждение

Этот протокол описывает способ получения МК, способного испускать проплацелеты из ГП, полученных из крови, и высвобождать тромбоциты из культурального носителя. HP получают из LRF, побочного продукта банков крови, используемого для удаления загрязняющих лейкоцитов из клеточных продукто...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material