Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Diferenciação e Formação de Plaquetas

Resumo

Este protocolo descreve em detalhes todas as etapas envolvidas na obtenção de progenitores hematopoiéticos derivados de leucofilter e sua diferenciação in vitro e maturação em megacaiócitos portadores de proplatelet que são capazes de liberar plaquetas no meio da cultura. Este procedimento é útil para uma análise aprofundada dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a megacaripoiese.

Resumo

A expansão in vitro e a diferenciação de progenitores hematopoiéticos humanos em megacaiócitos capazes de alongar proplatelets e liberar plaquetas permite um estudo aprofundado dos mecanismos subjacentes à biogênese plaquetária. Os protocolos de cultura disponíveis são baseados principalmente em progenitores hematopoiéticos derivados de medula óssea ou sangue do cordão umbilical levantando uma série de preocupações éticas, técnicas e econômicas. Se já existem protocolos disponíveis para a obtenção de células CD34 a partir de sangue periférico, este manuscrito propõe um protocolo simples e otimizado para a obtenção de células CD34+ a partir de filtros de leucodepleção prontamente disponíveis em hemocentros. Estas células são isoladas de filtros de leucodepleção utilizados na preparação de produtos de transfusão de sangue, correspondendo a oito doações de sangue. Estes filtros devem ser descartados. Um procedimento detalhado para coletar progenitores hematopoiéticos identificados como células CD34+ desses filtros é descrito. O método para obter megacaiócitos maduros estendendo proplatelets enquanto discute sua evolução fenotípica também é detalhado. Finalmente, o protocolo apresenta um método calibrado de pipetação, para liberar eficientemente plaquetas que são morfologicamente e funcionalmente semelhantes às nativas. Este protocolo pode servir de base para avaliar compostos farmacológicos que atuam em várias etapas do processo para dissecar os mecanismos subjacentes e abordar os rendimentos da plaqueta in vivo.

Introdução

As plaquetas de sangue vêm de grandes células poliploides especializadas, os megacaiócitos (MK), que se originam de um processo de produção constante e afinado conhecido como megacariopoiesis (MKP). No ápice desse processo estão células-tronco hematopoiéticas que, em contato com o ambiente de medula óssea (citocinas, fatores de transcrição, nicho hematopoiético), poderão proliferar e diferenciar-se em progenitores hematopoiéticos (HP) capazes de se comprometer em direção à via megacariocítica, dando origem a MKs imaturos¹. Sob a influência de várias citocinas, e em particular trombopoietina (TPO), que é a principal citocina de MKP; o MK passará então por dois grandes estágios de maturação: a endomitose e o desenvolvimento de membranas de demarcação (DMS). Este MK totalmente maduro aparece perto de um vaso sinusoide no qual pode emitir extensões citoplasmáticas, as propuladas, que serão liberadas sob o fluxo sanguíneo e posteriormente remodeladas em plaquetas funcionais². A clonagem de TPO em 1994³ proporcionou um impulso no estudo do MKP, acelerando o desenvolvimento de técnicas de cultura in vitro permitindo a diferenciação da HP e o amadurecimento do MK.

Existem muitas patologias que afetam as plaquetas sanguíneas, tanto em termos de número de plaquetas (aumento ou diminuição) quanto função^4,5. Ser capaz de recapitular o MKP in vitro da HP humana poderia melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes a esse processo e, em última instância, o gerenciamento terapêutico dos pacientes.

Várias fontes de HP humano são adequadas: sangue do cordão umbilical, medula óssea e sangue periférico^6,7,8. A colheita de HP do sangue periférico levanta menos problemas logísticos e éticos do que sua recuperação do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea. A HP pode ser recuperada de leucemia ou casaco buffy, mas essas fontes são caras e nem sempre estão disponíveis em hemocentros. Outros protocolos, menos caros e mais fáceis de executar, permitem a recuperação direta das células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs) sem a necessidade de isolamento prévio orientado por CD34^4,8. No entanto, a pureza dos megacaitos não é satisfatória com este método e uma seleção de células CD34+ do PBMC é recomendada para a melhor diferenciação em MK. Isso nos levou a implementar uma purificação hp a partir de filtros de leucoredução (LRF), rotineiramente usados em bancos de sangue para remover glóbulos brancos e, assim, evitar reações imunológicas adversas⁹. De fato, desde 1998, os concentrados de plaquetas foram automaticamente leucodepclados na França. Ao final desse processo, a LRF é descartada e todas as células retidas na LRF são destruídas. As células em LRFs estão, portanto, prontamente disponíveis sem custo adicional. Os LRFs têm um conteúdo celular próximo ao obtido por leucemia ou em casacos buffy, notadamente em sua composição de CD34+ HP tornando-os uma fonte notavelmente atraente¹⁰. A LRF como fonte humana de HP já foi demonstrada para fornecer células com capacidades funcionais intactas¹¹. Essa fonte tem a vantagem de ser abundante e acessível para pesquisas laboratoriais. Nesse contexto, este artigo descreve sucessivamente: i) a extração e seleção de CD34⁺ HP de LRFs; ii) uma cultura otimizada em duas fases, que recapitula o compromisso da HP na via megacariocítica e o amadurecimento do MK capaz de emitir proplatelets; iii) um método para liberar eficientemente plaquetas deste mk; e iv) um procedimento para fenotipagem MK e plaquetas cultivadas.

Protocolo

Foram obtidas amostras humanas de controle de doadores de sangue volonteer que deram consentimento por escrito recrutado pelo centro de transfusão de sangue onde a pesquisa foi realizada (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Todos os procedimentos foram registrados e aprovados pelo Ministério da Educação Superior e Pesquisa da França e registrados sob o número AC_2015_2371.Os doadores deram sua aprovação no formulário de consentimento do CODHECO AC- 2008 - 562, para que as amostras fossem utilizadas para fins de pesquisa. Os estudos em humanos foram realizados de acordo com a declaração de Helsinque.

1. Extração e seleção de células CD34+ (HP) da LRF

1. Preparação do reagente (para uma LRF)
   1. Prepare 25 mL de tampão de eluição filtrada: 21,25 mL de Salina Tamponada fosfato (PBS), 2,5 mL de Ácido-Citrato-Dextrose (ACD) e 1,25 mL de Soro Fetal Bovino descomplementado (FBS). Filtrar em 0,22 μm e colocar a 37 °C.
   2. Prepare 500 mL de PBS com 2 mM de ácidotraacético e etilenodiaminete (EDTA).
   3. Descarte 25 mL de gradiente de densidade (DGM) (1,077 g/mL) em dois tubos de 50 mL.
2. LRF back-flushing modalidades (Figura 1)
   NOTA: Esta etapa requer uma máquina de solda de tubo estéril, permitindo a conexão estéril de tubos termoplásticos.
   1. Primeiro, conecte o LRF a uma bolsa de transferência vazia de 600 mL e a LRF a um conjunto de tubos(Figura 1A). Sob o gabinete de biossegurança, injete o volume total de tampão de elução filtrado e preparado correspondente ao número de LRFs manuseados (xLRF x 25 mL) no saco vazio. Em seguida, utilizando uma seringa de 30 mL para aspirar suavemente todo o conteúdo do saco através do LRF, retrocede e transferir as células para um novo tubo de 50 mL(Figura 1B).
   2. Para a sedimentação dos glóbulos vermelhos, diluir a suspensão celular pela metade com o Dextran 2% e misturar bem para agregar glóbulos vermelhos. Aguarde 30 min em temperatura ambiente (RT).

Figura 1: LRF volta às modalidades de descarga. (A) Regime representativo de (i) a conexão estéril da bolsa de transferência para a LRF e (ii)o tubo definido para a LRF. (B) Esquema representativo da conexão das seringas para coleta de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Coleção PBMC
   1. Seguindo a sedimentação dos glóbulos vermelhos, remova e transfira o supernante em um tubo de 50 mL e preencha-o com PBS-EDTA 2 mM. Sobreponha suavemente o sobrenatante ao DGM acima preparado. Deixe o supernatante fluir suavemente sem quebrar o plano superficial do gradiente de densidade. Centrifugar a 400 x g em RT por 30 min no modo de desligar o freio.
   2. Colete a camada PBMC com uma pipeta de transferência descartável. Transfira as células de cada tubo DGM para um novo tubo estéril de 50 mL. Encha cada tubo com PBS-EDTA 2 mM e lave duas vezes em 50 mL de PBS-EDTA 2 mM a 200 x g por 10 min no RT no freio no modo.
   3. Pipeta fora e piscina a pelota celular com 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
      NOTA: Existe a possibilidade de interromper o procedimento mantendo as células coletadas sob agitação a 4 °C durante a noite. Em seguida, filtre a suspensão com um coador de células de 40 μm para remover os agregados formados.
4. Seleção de células CD34+
   1. Determine o número do celular e a centrífuga a 400 x g em temperatura ambiente por 10 minutos com o rompimento.
   2. Aspire completamente o supernascedor e resuspenque no volume apropriado de PBS-EDTA 2 mM detalhado pelo fabricante do kit de seleção CD34 (300 μL de PBS-EDTA para 10⁸ células). Adicione o Reagente bloqueador de FcR e as Microesferas CD34 na concentração apropriada (50 μL para 10⁸ células).
   3. Após 30 min a 4 °C, lave a suspensão celular e ressuspenda no volume apropriado de PBS-EDTA 2 mM detalhado pelo fabricante do kit de seleção CD34 (500 μL por 10⁸ células).
      NOTA: A seleção é feita em colunas de classificação para a passagem de no máximo 2 x 10⁹ células por coluna.
   4. Passe a amostra sobre a coluna molhada do ímã. Lave duas vezes com 3 mL de PBS-EDTA 2 mM e elute as células com 5 mL de PBS-EDTA 2 mM. Uma segunda corrida em uma nova coluna após o mesmo procedimento é necessária para melhorar a pureza da amostra.
      NOTA: Um número esperado de 6,1 x 10⁵ células/LRF (Figura 2A). Para maiores números de LRF, aumente os reagentes e métodos em conformidade.
5. Avaliação da pureza celular CD34+
   1. Adicione a uma alíquota de 100 μL de suspensão obtida após a seleção CD34^+, 2 μL de anticorpo cd34-PE humano ou 2 μL de IgG - PE (controle). Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.
   2. Lave as células adicionando 2 mL de PBS e centrífuga a 400 x g por 5 min. Aspirar supernaente completamente e resuspend em 200 μL de PBS.
   3. Analise a pureza por citometria de fluxo, como mostrado na Figura 2A e na Discussão.
      NOTA: Espera-se uma pureza de células CD34+ acima de 90%(Figura 2Bii).
   4. Use as células CD34+ diretamente ou congele para uso posterior.
6. Cd34+ células congelando
   NOTA: O congelamento das células CD34+ é feito a uma densidade de 10⁶ células por mL.
   1. Seguindo a determinação do número de celular CD34+, prepare os seguintes meios de criopreservação: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Hasspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) e permita o resfriamento a 4 °C.
   2. Centrifugar as células CD34+ a 400 x g em temperatura ambiente por 5 minutos e resuspensar a pelota na solução fria 1 e, em seguida, imediatamente adicionar à solução fria 2 (v/v).
   3. Coloque os criobotos imediatamente em um congelador de -80 °C por 24 h e, em seguida, transfira criobotos para o tanque de nitrogênio líquido.

2. Cultura e diferenciação de células CD34+ para produzir megacaiócitos maduros de proplatelet

NOTA: Protocolo de culturacelular (Figura 3A),esquema representativo do procedimento de cultura celular são detalhados nesta seção.

1. Células CD34+ descongelando (se necessário)
   1. Prepare a solução de degelo: 13 mL de PBS-20% FBS e coloque a 37 °C por 15 min. Transfira rapidamente os criobotos para um banho de água de 37 °C até que apenas um pequeno cristal de gelo. Sob o gabinete de cultura biológica, pipeta todo o conteúdo, e lentamente transferir em 13 mL de solução de descongelamento pré-armado.
   2. Determine o número do celular e a viabilidade celular.
2. Protocolo de cultura, passo 1: do dia 0 ao dia 7
   NOTA: Geralmente as culturas são feitas em placas de 24 poços com 1 mL de médio por poço a uma densidade de 40.000 células viáveis/mL, correspondendo a 20.000 células viáveis/cm². É crucial respeitar essa densidade se alguma escala for planejada.
   1. Preparação média de crescimento : Em mídia de expansão de células hematopoiéticas livres de soro (anteriormente aquecida a 37 °C) adicione Penicillin-Streptomicina-Glutamina (PSG) 1x, Lipoproteína de Baixa Densidade humana (hLDL) a 20 μg/mL, coquetel de citocina de expansão de megacaiócito 1x e Stemregenin 1 (SR1) a 1 μM.
   2. Semeadura celular : Centrifugar as células CD34+ descongeladas a 400 x g em temperatura ambiente por 5 min. Remova completamente o supernasce e resuspenha a pelota celular em 1 mL de mídia cultural e realize uma numeração celular e viabilidade para determinar o volume apropriado para semear as células.
   3. Centrifugar as células 400 x g à temperatura ambiente por 5 min e resuspensar a pelota no volume apropriado do meio de crescimento quente. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ durante 7 dias.
3. Protocolo de cultura, passo 2: do dia 7 ao dia 13 (Figura 3B, imagens representativas no dia 13)
   NOTA: Geralmente as culturas são feitas em placas de 24 poços com 1 mL de médio por poço a uma densidade de 50.000 células viáveis/mL, correspondendo a 25.000 células viáveis/cm². É crucial respeitar essa densidade se alguma escala for planejada.
   1. Preparação média de maturação: Em mídia de expansão de células hematopoiéticas sem soro (anteriormente aquecida a 37 °C) adicione PSG 1x, hLDL a 20 μg/mL, TPO a 50 ng/mL e SR1 a 1 μM.
   2. Examine as células sob o microscópio. No dia 7, as células exibem uma aparência redonda e homogênea preenchendo os poços ou os frascos sem serem muito confluentes.
   3. Sob um armário de biossegurança, transfira suavemente as células em um tubo de 15 mL. Lave poços com PBS. Em seguida, determine o número de células e sua viabilidade para calcular o volume apropriado para semear as células.
   4. Centrifugar as células a 400 x g em temperatura ambiente por 5 min. Remova o supernatante e resuspenque as células no volume apropriado de mídia quente calculada na etapa anterior. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ por 6 dias.
4. Lançamento de plaquetas cultivadas no dia 13
   1. Adicione 0,5 μM de prostaglandina I₂ (PGI₂₎ e 0,02 U/mL de apyrase à cultura e realize five vezes sucessivas pipetting com uma pipeta de 1 mL.
      NOTA: As plaquetas estão agora liberadas no meio.

3. Análise da citometria de fluxo (fenotipagem mk e contagem de plaquetas cultivadas)

NOTA: Este protocolo pode ser aplicado ao fenotipagem das células nos dias de cultura selecionados. Também permite a determinação do número da liberação de plaquetas cultivadas (Figura 4A,B).

1. Preparação para análise de MK
   1. Rotular quatro conjuntos de tubos de microcentrifuge da seguinte forma: Células sem rótulo como controle, células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Células + 5 μL CD34 - PECy7, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Use um mínimo de 1,10⁵ células por tubo, não exceda 1,10⁶ células por tubo. Adicione a 100 μL de suspensão celular por tubo de citometria e os diferentes anticorpos. Incubar no escuro por 30 min a 4 °C.
   2. Em seguida, adicione 2 mL de PBS-EDTA 2 mM por tubo e centrífuga a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente. Durante a centrifugação, prepare uma solução de PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomicin-D (7AAD) (1/100), permita uma solução de 300 μL por tubo.
   3. Remova o supernatante e pegue a pelota em 300 μL de PBS-EDTA 2 mM com 7AAD. Passe amostras através do citômetro de fluxo dentro de 30 minutos.
      NOTA: A estratégia de análise da citometria de fluxo é mostrada na Figura 3C e na Discussão.
2. Preparação do tubo para análise de plaquetas cultivadas
   1. Rotular quatro conjuntos de tubos de microcentrifuuge da seguinte forma: Células sem rótulo como controle, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Células + 20 μL CD42a - PE, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Após cinco pipetting sucessivas em bem cultura, transfira 300 μL da suspensão no tubo para citometria contendo um número calibrado de contas fluorescentes.
   2. Adicione anticorpos e incubar no escuro em RT por 30 minutos.
   3. Passe as amostras através do citômetro de fluxo dentro de 30 minutos e defina a aquisição para a passagem de 5.000 contas.
      NOTA: A estratégia de análise da citometria de fluxo é mostrada na Figura 4B e na Discussão.

Resultados

Extração e seleção de células CD34+ de LRFs
Aqui, o método, derivado de Peytour et al.^9,descreve a extração e seleção de células CD34⁺ de LRFs descartados disponíveis em bancos de sangue após a remoção de leucócitos. Seguindo o procedimento de retroafismo, geralmente 1,03 x 10⁹ ± 2,45 x 10⁸ células/LRF (Média±SEM; n = 155) são recuperados com uma viabilidade de 94,88 ± 0,10%(Figura 2A i...

Discussão

Este protocolo descreve um método para produzir MK capaz de emitir proplatelets da HP derivada do sangue e para liberar plaquetas do meio de cultura. A HP é obtida da LRF, um subproduto dos bancos de sangue, usado para remover leucócitos contaminantes de produtos sanguíneos celulares e evitar reações adversas. Embora este método seja relativamente simples, alguns pontos merecem atenção especial.

A deposição da suspensão celular no meio gradiente de densidade (etapa 1.3.1) deve ser ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material