류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

요약

이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.

초록

자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

서문

혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기^세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판^2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년^3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.

혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능^4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이^있다. 인간 HP에서 시험관에서 MKP를 다시 수면할 수 있다는 것은 이 과정의 근간을 근로하고 궁극적으로 환자의 치료 관리를 위한 분자 및 세포 기계장치의 이해를 향상시킬 수 있었습니다.

인간의 HP의 다양한 소스는 적합하다 : 코드 혈액, 골수, 말초 혈액^6,7,8. 말초 혈액에서 HP를 수확하는 것은 코드 혈액 또는 골수에서 회복하는 것보다 덜 물류 및 윤리적 문제를 제기합니다. HP는 백혈구 또는 버피 코트에서 복구 할 수 있지만, 이러한 소스는 비싸고 혈액 센터에서 항상 사용할 수 없습니다. 다른 프로토콜은, 더 저렴하고 수행하기 쉬운, 이전 CD34 구동^절연4에대한 필요없이 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 직접 복구를 허용^4,8. 그러나, 메가카요세포의 순도는 이 방법으로 만족스럽지 못하며 PBMC로부터 CD34+ 셀을 선택하여 MK로의 최적의 분화를 권장한다. 이것은 백혈구를 제거하고 따라서 불리한 면역 반응을 피하기 위하여 혈액 은행에서 일상적으로 이용되는 백혈구 감소 필터 (LRF)에서 HP 정화를 구현하기 위하여 저희를^{지도했습니다.} 실제로, 1998 년 이후, 혈소판 농축액은 자동으로 프랑스에서 백류오데트되었습니다. 이 과정이 끝나면 LRF가 폐기되고 LRF에 유지되는 모든 셀이 파괴됩니다. 따라서 LRF의 세포는 추가 비용 없이 쉽게 사용할 수 있습니다. LRF는 백혈구 또는 버피 코트에 의해 얻은 것과 가까운 셀룰러 함량을 가지고 있으며, 특히 CD34 + HP의 구성에서 놀랍도록 매력적인 소스^10을만듭니다. 인간 HP 소스로서의 LRF는 이미 세포에 온전한 기능성 용량을 제공하는 것으로^{입증되었다(11)}. 이 소스는 실험실 연구에 대 한 풍부 하 고 저렴 한 되 고의 장점이 있다. 이 맥락에서 이 문서에서는 연속적으로 설명합니다: i) LRFs의 CD34⁺ HP의 추출 및 선택; ii) 2단계 최적화 된 문화, 이는 발판을 방출 할 수있는 MK의 메가 카요 사이클 경로 및 성숙에 HP의 헌신을 재구성; iii) 이러한 MK로부터 혈소판을 효율적으로 방출하는 방법; 및 iv) Phenotyping MK 및 배양 혈소판에 대한 절차.

프로토콜

제어 인간 샘플은 연구가 수행 된 수혈 센터에 의해 모집 서면 통보 동의를 준 volonteer 혈액 기증자로부터 얻어졌다 (Etablissement 프랑수아 뒤 상 - 그랜드 에스트). 모든 절차는 프랑스 고등 교육 연구부에 의해 등록및 승인되었으며 AC_2015_2371 번호에 따라 등록되었습니다.기부자는 연구 목적으로 샘플을 사용하기 위해 CODHECO 번호 AC- 2008 - 562 동의 서에 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 인간 연구가 수행되었다.

1. LRF에서 CD34+ 셀(HP)의 추출 및 선택

1. 시약준비(LRF 1개)
   1. 여과 된 용출 버퍼 25 mL 준비 : 21.25 mL 의 인산 완충식 살린 (PBS), 산 성산 - 점막 - 덱스트로스 (ACD) 및 1.25 mL의 변형 된 태아 보빈 혈청 (FBS). 0.22 μm을 걸기하고 37 °C에서 놓습니다.
   2. 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 2mM로 PBS 500mL를 준비한다.
   3. 2개의 50mL 튜브에 25mL의 밀도 그라데이션 배지(DGM) (1.077 g/mL)를 폐기하십시오.
2. LRF 백 플러싱 양식(그림 1)
   참고: 이 단계에서는 멸균 튜브 용접 기가 필요하며 열가소성 튜브의 멸균 연결을 허용합니다.
   1. 먼저 LRF를 빈 600mL 이송 백과 LRF를 튜브세트(도 1A)에연결합니다. 생물 안전 캐비닛하에서, 빈 가방에 처리된 LRF(xLRF x 25 mL)의 수에 해당하는 필터링 및 준비된 용출 버퍼의 총 부피를 주입한다. 이어서, 30mL 주사기를 사용하여 LRF를 통해 가방의 전체 내용을 부드럽게 흡인시키고, 세포를 새로운 50mL튜브(도 1B)로이송한다.
   2. 적혈구 퇴적물, Dextran 2%로 세포 현탁액을 반으로 희석하고 적혈구를 집계하기 위해 잘 섞는다. 실온(RT)에서 30분 동안 기다립니다.

도 1: LRF 백 플러싱 양식. (a)LRF및 (ii) LRF에 대한 이송 가방의 멸균 연결 및(ii)튜브 세트의 대표적인 방식. (B)셀 수집을 위한 주사기의 연결의 대표적인 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. PBMC 컬렉션
   1. 적혈구 퇴적에 따라 상체를 50mL 튜브로 제거하고 전송하여 PBS-EDTA 2 mM으로 채웁니다. 상체를 위에서 준비한 DGM에 부드럽게 오버레이합니다. 밀도 그라데이션의 표면 평면을 손상시키지 않고 상체가 부드럽게 흐르게 하십시오. RT에서 400 x g의 원심 분리기는 브레이크 오프 모드에서 30 분 동안.
   2. 일회용 이송 파이펫으로 PBMC 레이어를 수집합니다. 각 DGM 튜브에서 새로운 멸균 50 mL 튜브로 세포를 전송합니다. 각 튜브를 PBS-EDTA 2m로 채우고 200 x g에서 PBS-EDTA 2 mM50mL로 두 번 세척하여 RT에서 10 분 동안 브레이크 모드로 세척하십시오.
   3. 파이펫 을 끄고 50 mL PBS-EDTA 2 mM로 셀 펠릿을 풀.
      참고: 야간 동안 4°C에서 교반하에서 수집된 세포를 유지하여 절차를 중지할 가능성이 있다. 이어서, 40 μm 셀 스트레이너로 서스펜션을 걸게 하여 형성된 응집체를 제거한다.
4. CD34+ 셀 선택
   1. 실온에서 400 x g의 셀 수와 원심분리기를 10분 동안 결정합니다.
   2. CD34 선택 키트의 제조업체에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피에서 슈퍼네티를 완전히 흡인하고 재연한다(10^8셀에 대한 PBS-EDTA의 300 μL). 적절한 농도에 FcR 차단 시약 및 CD34 마이크로비드를 추가합니다(10^8셀의 경우 50 μL).
   3. 4°C에서 30분 후, CD34 셀(108셀당 500 μL)의 제조사에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피로 셀 서스펜션을 세척하고 재연한다.
      참고: 열당 최대 2 x 10⁹ 셀의 통과를 위해 열을 정렬할 때 선택 항목이 만들어집니다.
   4. 자석의 젖은 열 위에 샘플을 전달합니다. PBS-EDTA 2 mM3mL로 두 번 세척하고 PBS-EDTA 2 mM의 5mL로 세포를 엘루트하십시오. 샘플의 순도를 향상시키기 위해 동일한 절차에 따라 새 컬럼에서 두 번째 실행이 필요합니다.
      참고: 예상 수 6.1 x 10⁵ 셀/LRF(그림2A). LRF 수치가 높을수록 시약 및 메서드를 확장합니다.
5. CD34+ 셀 순도 평가
   1. CD34⁺ 선택 후 얻어진 100 μL의 알리쿼트에 추가, 인간 CD34-PE 항체의 2 μL 또는 IgG -PE (대조군)의 2 μL. 잘 섞고 4 °C에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
   2. PBS와 원심분리기2mL을 400 x g에서 5분 동안 첨가하여 셀을 세척합니다. PBS의 200 μL에서 완전히 흡인 및 재중단.
   3. 그림 2A 및 토론에서와 같이 흐름 세포측정에 의해 순도를 분석한다.
      참고: 90% 이상의 CD34+ 셀의 순도가 예상됩니다(그림2Bii).
   4. CD34+ 셀을 직접 사용하거나 추가 사용을 위해 동결하십시오.
6. CD34+ 셀 동결
   참고: CD34+ 세포 동결은 mL당 10^6세포의 밀도로 수행된다.
   1. CD34+ 세포 수 결정에 따라 다음과 같은 냉동 보존 매체를 준비합니다: (1) 60% 줄기간 + 40% FBS, (2) 40% 줄기간 + 40% FBS + 20% 디메틸 설프리산화물(DMSO) 및 4°C에서 냉각을 허용한다.
   2. CD34+ 셀을 실온에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고 차가운 용액 1에서 펠릿을 다시 한 다음 즉시 차가운 용액 2 (v/v)에 추가합니다.
   3. 냉동튜브를 즉시 -80°C 냉동고에 넣고 24시간 동안 냉동튜브를 액체 질소 탱크로 옮춥시다.

2. 성숙한 프로플라틀 베어링 메가 카요세포를 생산하는 CD34+ 세포의 배양 및 분화

참고: 세포 배양프로토콜(도 3A),세포 배양 절차의 대표적인 방식은 이 섹션에 상세하다.

1. CD34+ 셀 해동(필요한 경우)
   1. 해동 용액 준비: PBS-20% FBS의 13mL및 15분 동안 37°C에 배치합니다. 냉동튜브를 작은 얼음 결정이 하나만 갈 때까지 37°C 의 수조로 빠르게 옮기습니다. 생물학적 배양 캐비닛하에서 전체 함량을 피펫하고, 예동 해동 용액의 13mL로 천천히 전송한다.
   2. 셀 수와 셀 생존 가능성을 결정합니다.
2. 문화 프로토콜, 1단계: 0일부터 7일까지
   참고: 일반적으로 배양은 20,000개의 실행 가능한 세포/cm^2에대응하는 40,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.
   1. 성장 매체 준비 : 혈청이없는 혈토포이틱 세포 팽창 매체 (이전에 37 °C로 가열)에서 페니실린 - 연쇄상 구균 - 글루타민 (PSG) 1x, 인간 저밀도 지단백 (hLDL)을 20 μg /mL, 메가 카르요시테 팽창 1x 및 줄기 줄기 11의 사이토카인 칵테일을 추가합니다.
   2. 세포 파종 : 5 분 동안 실온에서 400 x g에서 해동 된 CD34 + 세포를 원심 분리합니다. 상체를 철저히 제거하고 배양 배지의 1mL에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 결정하는 세포 수치 및 생존성을 수행한다.
   3. 원심분리기 세포는 실온에서 400 x g를 5분 동안 원심분리하고 따뜻한 성장 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재연한다. 7 일 동안 5 % CO_2로 37 °C에서 세포를 배양합니다.
3. 문화 프로토콜, 2단계: 7일부터 13일까지(그림 3B,13일째 대표 이미지)
   참고: 일반적으로 배양은 25,000개의 실행 가능한 세포/cm²에 해당하는 50,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.
   1. 성숙 배지 준비: 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 매체(이전에 는 37°C로 가열)에서 PSG 1x, hLDL 20 μg/mL, TPO at 50 ng/mL, SR1을 1 μM에 첨가한다.
   2. 현미경의 밑에 세포를 검사합니다. 7일째에, 세포는 너무 냉수하지 않고 우물이나 플라스크를 채우면 둥글고 균일한 외관을 표시합니다.
   3. 생물 안전 캐비닛 에서 15 mL 튜브에서 세포를 부드럽게 전달합니다. PBS로 우물을 씻으시면 됩니다. 그런 다음 셀 수를 결정하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 계산할 수 있는 생존력을 결정합니다.
   4. 실온에서 400 x g의 세포를 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 이전 단계에서 계산된 웜 미디어의 적절한 부피에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 세포를 37°C, 6일 동안 5%_CO2로 배양한다.
4. 13일째에 배양혈소판 방출
   1. 프로스타글란딘 I_{2(PGI 2)의} 0.5 μM과 0.02 U/mL의 어피라제를 배양에 추가하고 1mL 파이펫으로 5회 연속 파이펫을 연주합니다.
      참고 : 혈소판은 이제 매체로 방출됩니다.

3. 유동 세포측정 분석(MK 페노티핑 및 배양 혈소판 수)

참고: 이 프로토콜은 선택한 배양 일에 셀의 페노티핑에 적용할 수 있습니다. 또한 배양 된 혈소판 방출의 수(도 4A,B)의측정을 허용합니다.

1. MK 분석 준비
   1. 다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 5 μL CD34 - PECy7, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 5 μL CD34 - 5 μL CD34 - PECy7. 튜브 당 최소 1.10⁵ 세포를 사용 하 여 튜브 당 1.10⁶ 세포를 초과 하지 마십시오. 세포측정관 및 상이한 항체당 세포 현탁액의 100 μL에 추가하십시오. 4 °C에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
   2. 그런 다음 튜브당 PBS-EDTA 2mM의 2mL을 넣고 상온에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기를 추가합니다. 원심 분리 하는 동안, PBS-EDTA 2 mM + 7-아미노 락티노마이신-D (7AAD) (1/100)의 솔루션을 준비 하 고, 튜브 당 300 μL 용액을 허용.
   3. 상체를 제거하고 7AAD와 PBS-EDTA 2 mM의 300 μL에서 펠릿을 차지합니다. 30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행합니다.
      참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 3C 및 토론에표시됩니다.
2. 배양 혈소판 분석을 위한 튜브 준비
   1. 다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 20 μL CD42a - PE, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 20 μL CD42a - PE. 배양에서 5회 연속 배관에 이어, 형광구의 보정수를 포함하는 세포형을 위해 튜브에서 서스펜션의 300 μL을 이송한다.
   2. 30 분 동안 RT에서 어둠 속에서 항체를 추가하고 배양하십시오.
   3. 30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행하고 5,000개의 구슬 을 통과하는 데 대한 인수를 설정합니다.
      참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 4B 및 토론에서표시됩니다.

결과

LRF에서 CD34+ 셀 추출 및 선택
여기서, Peytour^{외. 9로부터}유래된 방법은 백혈구 제거 후 혈액 은행에서 사용할 수 있는 버려진 LRFs로부터 CD34+ 세포의 추출 및 선택을 설명한다. 백플러시 절차에 따라, 보통 1.03 x 10⁹ ± 2.45 x 10⁸ 세포/LRF(Mean±SEM; n =155)는 94.88 ± 0.10%의 생존율로 회복된다(그림2A i). CD34 양성 선택 ?...

토론

이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.

밀도 그라데이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material