Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

Özet

Bu protokol, lökofilter türevi CD34+ hematopoetik progenitörlerin elde edilmesi ve bunların kültür ortamında trombositleri serbest bırakabilen proplatelet taşıyan megakaryositlere in vitro farklılaşması ve olgunlaşması ile ilgili tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar. Bu prosedür, megakaryopoezleri kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaların derinlemesine analizi için yararlıdır.

Özet

İnsan hematopoetik progenitörlerin proplatletleri uzatabilen ve trombositleri serbest bırakabilen megakaryositlere in vitro genişlemesi ve farklılaşması, trombosit biyogenezinin altında kalan mekanizmaların derinlemesine incelenmesini sağlar. Mevcut kültür protokolleri çoğunlukla kemik iliği veya kordon kanından elde edilen hematopoetik progenitörlere dayanır ve bir dizi etik, teknik ve ekonomik endişeyi yükseltir. Periferik kandan CD34 hücreleri elde etmek için zaten mevcut protokoller varsa, bu makale kan merkezlerinde kolayca bulunan leukodepletion filtrelerinden CD34+ hücreleri elde etmek için basit ve optimize edilmiş bir protokol önermektedir. Bu hücreler, sekiz kan bağışına karşılık gelen kan transfüzyon ürünlerinin hazırlanmasında kullanılan leukodepletion filtrelerinden izole edilmiştir. Bu filtrelerin atılması gerekir. Cd34+ hücreleri olarak tanımlanan hematopoetik progenitörleri bu filtrelerden toplamak için ayrıntılı bir prosedür açıklanmıştır. Fenotipik evrimlerini tartışırken proplateletleri genişleten olgun megakaryositler elde etme yöntemi de ayrıntılı olarak açıktır. Son olarak, protokol, morfolojik ve işlevsel olarak yerel olanlara benzer trombositleri verimli bir şekilde serbest bırakmak için kalibre edilmiş bir pipetleme yöntemi sunar. Bu protokol, alttaki mekanizmaları parçalamak ve in vivo trombosit verimine yaklaşmak için sürecin çeşitli adımlarında hareket eden farmakolojik bileşiklerin değerlendirilmesi için bir temel görevi görebilirsiniz.

Giriş

Kan trombositleri, megakaryopoez (MKP) olarak bilinen sabit ve ince ayarlı bir üretim sürecinden kaynaklanan özel büyük poliploid hücrelerden, megakaryositlerden (MK) gelir. Bu sürecin en başında, kemik iliği ortamıyla temas halinde (sitokinler, transkripsiyon faktörleri, hematopoetik niş) çoğalabilecek ve hematopoetik progenitörlere (HP) dönüşebilecek ve olgunlaşmamış^MK'larayol açan hematopoetik progenitörlere (HP) dönüşebilecek hematopoetik kök hücreler vardır. Çeşitli sitokinlerin ve özellikle MKP'nin ana sitokini olan trombopoietin (TPO) etkisi altında; MK daha sonra olgunlaşmanın iki ana aşamasından geçecektir: endokatoz ve sınır membranlarının (DMS) gelişimi. Bu tamamen olgun MK daha sonra sitoplazmik uzantılar yayabileceği bir sinüzoid damara yakın görünür, kan akışı altında serbest bırakılacak ve daha sonra fonksiyonel trombositler halinde yeniden şekillendirilecek proplateletler². 1994^3'te TPO'nun klonlanması, HP farklılaşmasına ve MK olgunlaşmasına izin veren in vitro kültür tekniklerinin geliştirilmesini hızlandırarak MKP'nin çalışmasında bir destek sağladı.

Kan trombositlerini etkileyen birçok patoloji vardır, hem trombosit sayısı (artış veya azalma) hem de fonksiyon^4,5. MKP in vitro'yu insan HP'sinden geri alabilmek, bu sürecin altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaların ve nihayetinde hastaların terapötik yönetiminin anlaşılmasını artırabilir.

çeşitli insan HP kaynakları uygundur: kordon kanı, kemik iliği ve periferik kan^6,7,8. HP'nin periferik kandan toplanması, kordon kanından veya kemik iliğinden iyileşmelerinden daha az lojistik ve etik sorunları gündeme getirmektedir. HP lökerez veya buffy coat'dan kurtarılabilir, ancak bu kaynaklar pahalıdır ve kan merkezlerinde her zaman mevcut değildir. Daha az pahalı ve daha kolay gerçekleştirilen diğer protokoller, önceden CD34 tahrikli izolasyon^4,8'egerek kalmadan insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) doğrudan iyileşmesine izin verir. Bununla birlikte, megakaryositlerin saflığı bu yöntemle tatmin edici değildir ve MK'ye optimal farklılaşma için PBMC'den CD34+ hücre seçimi önerilir. Bu, beyaz kan hücrelerini çıkarmak ve böylece olumsuz immünolojik reaksiyonlardan kaçınmak için kan bankalarında rutin olarak kullanılan lökoredüksiyon filtrelerinden (LRF) bir HP saflaştırması uygulamamıza neden oldu⁹. Nitekim, 1998'den beri Trombosit konsantreleri Fransa'da otomatik olarak leukodeplet edilmiştir. Bu işlemin sonunda LRF atılır ve LRF'de tutulan tüm hücreler yok edilir. Bu nedenle, LRF'lerdeki hücreler ek ücret ödemeden kolayca kullanılabilir. LRF'ler, lökerez veya buffy coats tarafından elde edilene yakın bir hücresel içeriğe sahiptir, özellikle CD34 + HP bileşimlerinde onları son derece çekici bir kaynak¹⁰. Bir insan HP kaynağı olarak LRF, hücrelere sağlam fonksiyonel kapasiteler sağlamak için zaten gösterilmiştir¹¹. Bu kaynak laboratuvar araştırmaları için bol ve uygun fiyatlı olma avantajına sahiptir. Bu bağlamda, bu makalede art arda açıklanmaktadır: i) CD34⁺ HP'nin LRF'lerden çıkarılması ve seçilmesi; ii) HP'nin megakaryositik yola olan bağlılığını ve proplatelet yayabilen MK'nın olgunlaşmasını yeniden düzenleyen iki fazlı optimize edilmiş bir kültür; iii) trombositleri bu MK'dan verimli bir şekilde serbest bırakmak için bir yöntem; ve iv) fenotipleme MK ve kültürlü trombositler için bir prosedür.

Protokol

Kontrol insan örnekleri, araştırmanın yapıldığı kan transfüzyon merkezi (Etablissement Français du Sang-Grand Est) tarafından işe alınan yazılı bilgilendirilmiş onay veren volonteer kan bağışçılarından alınmıştır. Tüm prosedürler Fransa Yükseköğretim ve Araştırma Bakanlığı tarafından tescil ve onaylanmış ve AC_2015_2371 numarası altında tescil edilmiştir.Bağışçılar, numunelerin araştırma amacıyla kullanılabilmesi için CODHECO numarası AC- 2008 - 562 onay formunda onay vermiştir. Helsinki bildirgesine göre insan çalışmaları yapıldı.

1. LRF'den CD34+ hücrelerinin (HP) çıkarılması ve seçimi

1. Reaktifin hazırlanması (bir LRF için)
   1. 25 mL filtrelenmiş elüsyon tamponu hazırlayın: 21,25 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 2,5 mL Asit-Sitrat-Dekstroz (ACD) ve 1,25 mL ayrışmış Fetal Sığır Serumu (FBS). 0,22 μm'ye filtreleyin ve 37 °C'ye yerleştirin.
   2. 2 mM etileniamintetraasetik asit (EDTA) ile 500 mL PBS hazırlayın.
   3. 25 mL yoğunluk degrade ortamını (DGM) (1.077 g/mL) iki adet 50 mL tüpe atın.
2. LRF geri yıkama yöntemleri (Şekil 1)
   NOT: Bu adım, termoplastik borunun steril bağlantısını sağlayan steril bir tüp kaynak makinesi gerektirir.
   1. İlk olarak, LRF'yi boş bir 600 mL transfer çantasına ve LRF'yi bir boru setine bağlayın (Şekil 1A). Biyogüvenlik kabininin altında, ele alınan LRF sayısına (xLRF x 25 mL) karşılık gelen filtrelenmiş ve hazırlanmış elüasyon tamponunun toplam hacmini boş torbaya enjekte edin. Daha sonra, çantanın tüm içeriğini LRF'den hafifçe epire etmek için 30 mL şırıngır kullanarak, hücreleri geri fırlayın ve yeni bir 50 mL tüpe aktarın (Şekil 1B).
   2. Kırmızı kan hücrelerinin çökeltilmesine, hücre süspansiyonunu Dextran% 2 ile yarı yarıya seyreltin ve kırmızı kan hücrelerini toplamak için iyice karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika bekleyin.

Şekil 1: LRF geri yıkama yöntemleri. (A) (i) transfer çantasının LRF'ye steril bağlantısı ve (ii) boru LRF'ye ayarlanmıştır. (B) Hücre toplama için şırınnaların bağlantısının temsili şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. PBMC koleksiyonu
   1. Kırmızı kan hücrelerinin tortulaşmasını takiben, süpernatantı çıkarın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve PBS-EDTA 2 mM ile doldurun. Yukarıda hazırlanmış DGM'ye süpernatantı hafifçe örtün. Yoğunluk gradyanının yüzey düzlemini kırmadan süpernatantın hafifçe akmasını sağlar. Frenleme modunda 30 dakika boyunca RT'de 400 x g'da santrifüj.
   2. PBMC katmanını tek kullanımlık transfer pipeti ile toplayın. Hücreleri her DGM tüpünden yeni bir steril 50 mL tüpe aktarın. Her tüpü PBS-EDTA 2 mM ile doldurun ve 50 mL PBS-EDTA 2 mM'de iki kez 200 x g'da RT'de 10 dakika boyunca fren modunda yıkayın.
   3. Pipet kapalı ve 50 mL PBS-EDTA 2 mM ile hücre pelet havuz.
      NOT: Toplanan hücreleri gece boyunca 4 °C'de ajitasyon altında tutarak işlemi durdurma imkanı vardır. Ardından, oluşan agregaları çıkarmak için süspansiyonu 40 μm hücre süzgeçle filtreleyin.
4. CD34+ hücre seçimi
   1. Hücre numarasını ve santrifüjü oda sıcaklığında 400 x g'da 10 dakika boyunca mola ile belirleyin.
   2. Üstnatantı tamamen epire edin ve CD34 seçim kitinin üreticisi tarafından ayrıntılı olarak açıklanan uygun PBS-EDTA 2 mM hacminde yeniden biriktirin (10⁸ hücre için 300 μL PBS-EDTA). FcR blokaj Reaktifini ve CD34 Mikrobeadlarını uygun konsantrasyonda ekleyin (10⁸ hücre için 50 μL).
   3. 4 °C'de 30 dakika sonra, hücre süspansiyonu yıkayın ve CD34 seçim kitinin üreticisi tarafından ayrıntılı olarak açıklanan PBS-EDTA 2 mM'nin uygun hacminde yeniden biriktirin (10⁸ hücre başına 500 μL).
      NOT: Seçim, sütun başına en fazla 2 x 10⁹ hücre geçişi için sütunları sıralama üzerine yapılır.
   4. Numuneyi mıknatısın ıslak kolonunun üzerinden geçirin. 3 mL PBS-EDTA 2 mM ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 mL PBS-EDTA 2 mM ile elüte edin. Örneğin saflığını artırmak için aynı yordamı izleyen yeni bir sütunda ikinci bir çalışma gereklidir.
      NOT: Beklenen sayıda 6.1 x 10⁵ hücre/LRF (Şekil 2A). Daha yüksek LRF sayıları için reaktifleri ve yöntemleri buna göre ölçeklendirin.
5. CD34+ hücre saflığının değerlendirilmesi
   1. CD34⁺ seçiminden sonra elde edilen 100 μL süspansiyon, 2 μL insan CD34-PE antikoru veya 2 μL IgG - PE (kontrol) aliquot ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır.
   2. 5 dakika boyunca 400 x g'da 2 mL PBS ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Tamamen aspirat süpernatant ve PBS 200 μL resuspend.
   3. Şekil 2A'da ve Tartışma 'da gösterildiği gibi akış sitometrisine göre saflığı analiz edin.
      NOT: CD34+ hücrelerinin %90'ın üzerinde saflığı beklenmektedir (Şekil 2Bii).
   4. CD34+ hücrelerini doğrudan kullanın veya daha fazla kullanım için dondurun.
6. CD34+ hücreleri donuyor
   NOT: CD34+ hücre dondurma işlemi mL başına 10⁶ hücre yoğunluğunda yapılır.
   1. CD34+ hücre numarası belirlemesini takiben, aşağıdaki kriyoprezervasyon ortamını hazırlayın: (1) %60 Stemspan + %40 FBS, (2) %40 Stemspan + %40 FBS + %20 Dimetil Sülfit (DMSO) ve 4 °C'de soğumaya izin verin.
   2. CD34+ hücrelerini oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve peletin soğuk çözelti 1'de yeniden depolayın ve ardından hemen soğuk çözelti 2'ye (v/v) ekleyin.
   3. Kriyotüpleri hemen 24 saat boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirin ve ardından kriyotütleri sıvı nitrojen tankına aktarın.

2. Olgun proplatelet taşıyan megakaryositler üretmek için CD34+ hücrelerinin kültürü ve farklılaşması

NOT: Hücre kültürü protokolü (Şekil 3A), hücre kültürü prosedürünün temsili şeması bu bölümde ayrıntılı olarak yer uzamaktadır.

1. CD34+ hücreleri çözülme (gerekirse)
   1. Çözme çözeltisini hazırlayın: 13 mL PBS-20% FBS ve 15 dakika boyunca 37 °C'ye yerleştirin. Kriyotütleri sadece bir küçük buz kristaline kadar 37 °C'lik bir su banyosuna hızlı bir şekilde aktarın. Biyolojik kültür kabini altında, tüm içeriği pipet ve yavaşça 13 mL önceden ısıtılmamış çözülme çözeltisi aktarın.
   2. Hücre numarasını ve hücre canlılığını belirleyin.
2. Kültür protokolü, adım 1: 0 günden 7. güne
   NOT: Genellikle kültürler, 20.000 uygulanabilir hücre/cm^2'yekarşılık gelen 40.000 uygulanabilir hücre/mL yoğunluğunda kuyu başına 1 mL orta ile 24 kuyu plakalarında yapılır. Herhangi bir ölçek büyütme planlanıyorsa bu yoğunluğa saygı duymak çok önemlidir.
   1. Büyüme ortamı hazırlığı : Serumsuz hematopoetik hücre genleşme ortamlarında (daha önce 37 °C'ye ısıtılmış) Penisilin-Streptomisin-Glutamin (PSG) 1x, 20 μg / mL'de insan Düşük Yoğunluklu Lipoprotein (hLDL), megakaryosit genişlemesinin sitokin kokteyli 1x ve Stemregenin 1 (SR1) 1 μM'de ekleyin.
   2. Hücre tohumlama : Çözülen CD34+ hücrelerini oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Üstnatant iyice çıkarın ve hücre peletini 1 mL kültür ortamına yeniden depola ve hücreleri tohumlamak için uygun hacmi belirlemek için hücre sayısını ve canlılığını gerçekleştirin.
   3. Hücreleri oda sıcaklığında 400 x g 5 dakika santrifüj edin ve peletin ılık büyüme ortamının uygun hacminde yeniden depolayın. Hücreleri 7 gün boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
3. Kültür protokolü, adım 2: 7 günden 13. güne kadar(Şekil 3B, 13. günde temsili görüntüler)
   NOT: Genellikle kültürler, 25.000 uygulanabilir hücre/cm²'ye karşılık gelen 50.000 uygulanabilir hücre/mL yoğunluğunda kuyu başına 1 mL orta ile 24 kuyu plakalarında yapılır. Herhangi bir ölçek büyütme planlanıyorsa bu yoğunluğa saygı duymak çok önemlidir.
   1. Olgunlaşma ortamı hazırlama: Serumsuz hematopoetik hücre genleşme ortamına (daha önce 37 °C'ye ısıtılmış) PSG 1x, 20 μg/mL'de hLDL, 50 ng/mL'de TPO ve 1 μM'de SR1 ekleyin.
   2. Mikroskop altındaki hücreleri inceleyin. 7. günde, hücreler çok bir arada olmadan kuyuları veya şişeleri doldurarak yuvarlak ve homojen bir görünüm sergilerler.
   3. Bir biyogüvenlik kabini altında, hücreleri 15 mL'lik bir tüpe hafifçe aktarın. PBS ile kuyuları yıkayın. Daha sonra, hücre sayısını ve hücreleri tohumlamak için uygun hacmi hesaplamak için canlılıklarını belirleyin.
   4. Hücreleri oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüjlayın. Üst bileşeni çıkarın ve önceki adımda hesaplanan uygun sıcak ortam hacmindeki hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri 6 gün boyunca 37 °C, %5 CO_2'de kuluçkaya yatırın.
4. 13. günde kültürlü trombosit salınımı
   1. Kültüre 0,5 μM prostaglandine I₂ (PGI₂₎ ve 0,02 U/mL apyrase ekleyin ve 1 mL pipetle beş kez ardışık pipetleme gerçekleştirin.
      NOT: Trombositler artık ortama salınır.

3. Akış sitometri analizi (MK fenotipleme ve kültürlü trombosit sayısı)

NOT: Bu protokol, seçili kültür günlerinde hücrelerin fenotiplemesine uygulanabilir. Ayrıca kültürlü trombosit salınımının sayısının belirlenmesine izin verir (Şekil 4A, B).

1. MK analizine hazırlık
   1. Dört mikrosantrifüj tüp setini aşağıdaki gibi etiketleyin: Kontrol olarak etiketlenmemiş hücreler, hücreler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Hücreler + 5 μL CD34 - PECy7, Hücreler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Tüp başına en az 1.10⁵ hücre kullanın, tüp başına 1.10⁶ hücreyi aşmayın. Sitotemetri tüpü başına 100 μL hücre süspansiyonu ve farklı antikorlar ekleyin. 4 °C'de 30 dakika karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
   2. Ardından, tüp başına 2 mL PBS-EDTA 2 mM ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj ekleyin. Santrifüjleme sırasında, PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100) çözeltisi hazırlayın, tüp başına 300 μL çözeltiye izin verin.
   3. Üstnatantı çıkarın ve peleti 7AAD ile 300 μL PBS-EDTA 2 mM'de alın. Numuneleri akış sitometresi boyunca 30 dakika içinde çalıştırın.
      NOT: Akış sitometrisi için analiz stratejisi Şekil 3C'de ve Tartışma'da gösterilmiştir.
2. Kültürlü trombosit analizi için tüp hazırlığı
   1. Dört mikrosantrifüj tüp setini aşağıdaki gibi etiketleyin: Kontrol olarak etiketlenmemiş hücreler, Hücreler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Hücreler + 20 μL CD42a - PE, Hücreler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Kültür kuyusunda art arda beş pipetlemenin ardından, kalibre edilmiş sayıda floresan boncuk içeren sitotmetri için süspansiyonun 300 μL'sini tüpe aktarın.
   2. Antikor ekleyin ve RT'de 30 dakika karanlıkta kuluçkaya yatırın.
   3. Numuneleri 30 dakika içinde akış sitometresi boyunca çalıştırın ve 5.000 boncuk geçişi için kazanımı ayarlayın.
      NOT: Akış sitometrisi için analiz stratejisi Şekil 4B'de ve Tartışma'da gösterilmiştir.

Sonuçlar

LRF'lerden CD34+ hücrelerinin çıkarılması ve seçimi
Burada, Peytour ve ark.^9'dantüretilen yöntem, lökosit çıkarılmasından sonra kan bankalarında bulunan atılmış LRF'lerden CD34⁺ hücrelerin çıkarılmasını ve seçilmesini açıklar. Geri tepme prosedürünü takiben, genellikle 1.03 x^{10 9} ± 2.45 x 10⁸ hücre/ LRF (Ortalama±SEM; n = 155) % 94.88 ± 0.10 canlılık ile kurtarılır (Şekil 2A

Tartışmalar

Bu protokol, kan türevi HP'den proplatelet yayabilen MK üretmek ve trombositleri kültür ortamından serbest bırakmak için bir yöntem açıklanmaktadır. HP, hücresel kan ürünlerindeki kontamine lökositleri gidermek ve advers reaksiyonları önlemek için kullanılan kan bankalarının bir yan ürünü olan LRF'den elde edilir. Bu yöntem nispeten basit olmasına rağmen, birkaç nokta özel ilgiyi hak ediyor.

Hücre süspansiyonunun yoğunluk degrade ortamında (adım 1.3.1) birikme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material