תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

Summary

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את כל השלבים הכרוכים בהשגת CD34+ hematopoietic שמקורם ב- leukofilter ואת בידול המבחנה וההתבגרות שלהם למגקריוציטים נושאי פרופלטלט המסוגלים לשחרר טסיות דם במדיום התרבותי. הליך זה שימושי לניתוח מעמיק של מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים megakaryopoiesis.

Abstract

הרחבת במבחנה ובידול של אבות hematopoietic אנושי לתוך megakaryocytes מסוגל להאריך את מרחיבים ושחרור טסיות מאפשר מחקר מעמיק של המנגנונים שבבסיס ביוגנזה טסיות דם. פרוטוקולי התרבות הזמינים מבוססים בעיקר על אבות hematopoietic נגזר מח עצם או דם טבורי העלאת מספר חששות אתיים, טכניים וכלכליים. אם יש כבר פרוטוקולים זמינים להשגת תאי CD34 מדם היקפי, כתב יד זה מציע פרוטוקול פשוט וממוטב להשגת תאי CD34+ ממסנני לויקו-פלציה הזמינים במרכזי דם. תאים אלה מבודדים ממסנני לויקודלציה המשמשים להכנת מוצרי עירוי דם, המתאימים לשמונה תרומות דם. מסננים אלה אמורים להימחק. הליך מפורט לאיסוף אבות hematopoietic מזוהה כתאי CD34 + ממסננים אלה מתואר. השיטה להשיג megakaryocytes בוגר הרחבת פרופלטלטים תוך כדי דיון האבולוציה הפנוטיפית שלהם מפורט גם. לבסוף, הפרוטוקול מציג שיטת צנרת מכוילת, כדי לשחרר ביעילות טסיות דם הדומות מבחינה מורפולוגית ופונקציונלית לאלה ילידים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להערכת תרכובות פרמקולוגיות הפועלות בשלבים שונים של התהליך כדי לנתח את המנגנונים הבסיסיים ולגשת לתשואות טסיות ה- in vivo.

Introduction

טסיות הדם מגיעות מתאי פוליפלואיד גדולים מיוחדים, המגקריוציטים (MK), שמקורם בתהליך ייצור קבוע ומכוון המכונה megakaryopoiesis (MKP). בשיאו של תהליך זה נמצאים תאי גזע hematopoietic אשר, במגע עם סביבת מח העצם (ציטוקינים, גורמי שעתוק, נישה hematopoietic), יוכלו להתרבות ולהבדיל לתוך אבות hematopoietic (HP) מסוגל להתחייב לכיוון המסלול megakaryocytic, יצירת חברי פרל"ק לא בשלים¹. בהשפעת ציטוקינים שונים, ובמיוחד תרומבו-אפיטין (TPO), שהוא הציטוקינים העיקריים של MKP; לאחר מכן יעבור הח"כ שני שלבים עיקריים של התבגרות: אנדומיטוזיס ופיתוח ממברנות תיחום (DMS). ח"כ בוגר לחלוטין זה מופיע אז קרוב לכלי סינויד שבו הוא יכול לפלוט הרחבות ציטופלסמיות, את proplatelets, אשר ישוחררו תחת זרימת הדם ולאחר מכן שופץ לתוך טסיות תפקוד². השיבוט של TPO בשנת 1994 3 סיפק^דחיפה במחקר של MKP על ידי האצת הפיתוח של טכניקות תרבות במבחנה המאפשרות בידול HP והתבגרות MK.

ישנן פתולוגיות רבות המשפיעות על טסיות הדם, הן מבחינת מספר טסיות הדם (עלייה או ירידה) והן מבחינת פונקציה^4,5. היכולת לשחזר את MKP במבחנה של HP האנושית יכולה לשפר את ההבנה של המנגנונים המולקולריים והתאים שבבסיס תהליך זה ובסופו של דבר את הניהול הטיפולי של המטופלים.

מקורות שונים של HP האנושית מתאימים: דם טבורי, מח עצם, ודם היקפי^6,7,8. קצירת HP מדם היקפי מעלה פחות בעיות לוגיסטיות ואתיות מאשר החלמתן מדם טבורי או ממח העצם. ניתן לשחזר את HP מלוקפרזיס או מעיל באפי, אך מקורות אלה יקרים ולא תמיד זמינים במרכזי דם. פרוטוקולים אחרים, פחות יקר וקל לביצוע, מאפשרים התאוששות ישירה של תאים מונונוקלאריים בדם היקפי אנושי (PBMCs) ללא צורך בבידוד מונע CD34 קודם^4,8. עם זאת, טוהר המגקריוציטים אינו משביע רצון בשיטה זו ובחירה של תאי CD34+ מ- PBMC מומלצת לבידול אופטימלי לח"כ. זה הוביל אותנו ליישם טיהור HP ממסנני לויקורדוקציה (LRF), המשמש באופן שגרתי בבנקי דם כדי להסיר תאי דם לבנים ובכך למנוע תגובות חיסוניות שליליות⁹. ואכן, מאז 1998, תרכיזי טסיות דם כבר אוטומטי לויקודל בצרפת. בסוף תהליך זה, LRF נמחקים וכל התאים שנשמרו ב- LRF נהרסים. תאים במפות ה-LR הם, אם כן, זמינים ללא עלות נוספת. ל-LRFs יש תוכן סלולרי קרוב לזה המתקבל על ידי לויקפרזיס או במעילי באפי, במיוחד בהרכב של CD34+ HP, מה שהופך אותם למקור אטרקטיבי להפליא¹⁰. LRF כמקור HP אנושי כבר הוכח לספק לתאים יכולות תפקודיות שלמות¹¹. מקור זה יש את היתרון של להיות בשפע ובמחיר סביר למחקר מעבדה. בהקשר זה, מאמר זה מתאר ברציפות: i) את החילוץ והבחירה של CD34⁺ HP מ- LRFs; ii) תרבות ממוטבת דו-פאזית, אשר משחזרת את המחויבות של HP למסלול המגקריוציטי והבשלת ח"כים המסוגלים לפלוט מפיץ; iii) שיטה לשחרור יעיל של טסיות דם מח"כים אלה; ו-4) הליך של ח"כ פנוטיפינג וטסיות דם תרבותיות.

Protocol

דגימות אנושיות שליטה התקבלו מתורמי דם וולונטרים שנתנו הסכמה מדעת בכתב שגויסה על ידי מרכז עירוי הדם שבו בוצע המחקר (Etablissement Français du Sang-Grand Est). כל ההליכים נרשמו ואושרו על ידי המשרד הצרפתי להשכלה גבוהה ומחקר ונרשמו תחת המספר AC_2015_2371.התורמים נתנו את אישורם בטופס ההסכמה AC- 2008 - 562, על מנת שהדגימות ישמשו למטרות מחקר. מחקרים בבני אדם בוצעו על פי הצהרת הלסינקי.

1. מיצוי ובחירה של תאי CD34+ (HP) מ- LRF

1. הכנת ריאגנט (עבור LRF אחד)
   1. הכן 25 מ"ל של חוצץ אלוטיון מסונן: 21.25 מ"ל של תמיסת מלח חוצפת פוספט (PBS), 2.5 מ"ל של חומצה-סיטראט-דקסטרוז (ACD) ו 1.25 מ"ל של סרום בקר עוברי מפורק (FBS). מסננים על 0.22 מיקרומטר ומניחים ב 37 °C (50 °F).
   2. הכן 500 מ"ל של PBS עם 2 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA).
   3. יש להיפטר מ-25 מ"ל של מדיום הדרגתי בצפיפות (DGM) (1.077 גרם/מ"ל) בשני צינורות 50 מ"ל.
2. שיטות שטיפה אחורית של LRF (איור 1)
   הערה: שלב זה דורש מכונת ריתוך צינור סטרילי, המאפשר חיבור סטרילי של צינורות תרמופלסטיים.
   1. ראשית, חברו את ה-LRF לתיק העברה ריק של 600 מ"ל ול-LRF לסט צינורות(איור 1A). תחת ארון הבטיחות הביולוגית, הזרק את הנפח הכולל של מאגר אלוטיון מסונן ומוכן המתאים למספר ת.ז',500 שטופלו (xLRF x 25 מ"ל) לתוך השקית הריקה. לאחר מכן, באמצעות מזרק 30 מ"ל כדי לשאוף בעדינות את כל התוכן של התיק דרך LRF, backflush ולהעביר את התאים לתוך צינור חדש 50 mL (איור 1B).
   2. כדי משקעים תאי הדם האדומים, לדלל את השעיית התא על ידי חצי עם Dextran 2% ומערבבים היטב לצבור תאי דם אדומים. המתן 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).

איור 1: שיטות שטיפה אחוריות של LRF. (A)תוכנית מייצגת של (i) החיבור הסטרילי של תיק ההעברה ל- LRF ו -( ii) את צינורות להגדיר LRF. (B)ערכה מייצגת של חיבור המזרקים עבור איסוף תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. אוסף PBMC
   1. בעקבות משקעים תאי הדם האדומים, להסיר ולהעביר את supernatant לתוך צינור 50 מ"ל ולמלא אותו עם PBS-EDTA 2 mM. לכסות בעדינות את supernatant על DGM מוכן לעיל. תן לסופר-טבעי לזרום בעדינות מבלי לשבור את מישור פני השטח של שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 30 דקות במצב בלימה.
   2. אסוף את שכבת PBMC עם פיפטה העברה חד פעמית. העבר את התאים מכל צינור DGM לתוך צינור סטרילי חדש 50 מ"ל. מלא כל צינור עם PBS-EDTA 2 mM ולשטוף פעמיים ב 50 מ"ל של PBS-EDTA 2 mM ב 200 x g במשך 10 דקות ב RT במצב בלם על.
   3. פיפטה את ולאגד את גלולה התא עם 50 מ"ל PBS-EDTA 2 מ"מ.
      הערה: יש אפשרות להפסיק את ההליך על ידי שמירה על התאים שנאספו תחת עצבנות ב 4 °C (50 °F) במהלך הלילה. לאחר מכן, לסנן את ההשעיה עם מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להסיר את האגרגטים שנוצרו.
4. בחירת תאים של CD34+
   1. קבע את מספר התא ואת הצנטריפוגה ב 400 x g בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם ההפסקה על.
   2. שאף את supernatant לחלוטין resuspend בנפח המתאים של PBS-EDTA 2 mM המפורטים על ידי היצרן של ערכת הבחירה CD34 (300 μL של PBS-EDTA עבור 10⁸ תאים). הוסף את FcR חסימת ריאגנט ואת CD34 Microbeads בריכוז המתאים (50 μL עבור 10⁸ תאים).
   3. לאחר 30 דקות ב 4 °C (5 °F), לשטוף את השעיית התא resuspend בנפח המתאים של PBS-EDTA 2 mM המפורטים על ידי היצרן של ערכת הבחירה CD34 (500 μL לכל 10⁸ תאים).
      הערה: הבחירה נעשית במיון עמודות למעבר של 2 x 10⁹ תאים לכל עמודה.
   4. תעביר את הדגימה מעל העמוד הרטוב של המגנט. לשטוף פעמיים עם 3 מ"ל של PBS-EDTA 2 mM ול elute התאים עם 5 מ"ל של PBS-EDTA 2 mM. ריצה שנייה בעמודה חדשה לאחר אותו הליך נחוצה כדי לשפר את טוהר המדגם.
      הערה: מספר צפוי של 6.1 x 10⁵ תאים /LRF (איור 2A). לקבלת מספרי LRF גבוהים יותר, הרחב ריאגנטים ושיטות בהתאם.
5. הערכה של טוהר תאים CD34+
   1. הוסף aliquot של 100 μL של השעיה שהתקבל לאחר CD34⁺ בחירה, 2 μL של נוגדן CD34-PE אנושי או 2 μL של IgG - PE (שליטה). מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות ב 4 °C (7 °F).
   2. לשטוף תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות. שאף סופרנט לחלוטין ו resuspend ב 200 μL של PBS.
   3. נתחו את הטוהר לפי ציטומטריית זרימה כפי שמוצג באיור 2A ובדיון.
      הערה: צפוי טוהר של תאי CD34+ מעל 90% (איור 2Bii).
   4. השתמש ישירות בתאי CD34+ או קפא לשימוש נוסף.
6. CD34+ תאים קופאים
   הערה: CD34+ תאים הקפאה נעשית בצפיפות של 10⁶ תאים לכל mL.
   1. לאחר קביעת מספר התא CD34+ , הכן את מדיית ההקפאה הבאה: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואפשר קירור ב-4 °C (7%).
   2. צנטריפוגה CD34 + תאים ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ו resuspend הכדור בתמיסה קרה 1 ולאחר מכן מיד להוסיף לפתרון קר 2 (v / v).
   3. מניחים את cryotubes מיד לתוך -80 °C מקפיא במשך 24 שעות ולאחר מכן להעביר קריוטיוב לתוך מיכל חנקן נוזלי.

2. תרבות ובידול של תאי CD34+ לייצור מגהקריוציטים נושאי פרופלטים בוגרים

הערה: פרוטוקול תרבית תאים (איור 3A), ערכה מייצגת של הליך תרבית התא מפורטת בסעיף זה.

1. CD34+ תאים מפשירים (במידת הצורך)
   1. הכן את פתרון ההפשרה: 13 מ"ל של PBS-20% FBS ומניחים ב 37 °C (75 °F) במשך 15 דקות. מעבירים במהירות את הקריוטיוב לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד לקריסטל קרח אחד קטן בלבד. תחת ארון התרבות הביולוגית, pipette את כל התוכן, ולאט לאט להעביר ב 13 מ"ל של פתרון הפשרה מחמם מראש.
   2. קבע את מספר התא ואת הכדאיות של התא.
2. פרוטוקול תרבות, שלב 1: מיום 0 ועד היום 7
   הערה: בדרך כלל תרביות נעשות לוחות 24-well עם 1 מ"ל של בינוני לבאר בצפיפות של 40,000 תאים קיימא / מ"ל, המקביל 20,000 תאים קיימא / ס"מ². חשוב לכבד צפיפות זו אם מתוכנן שינוי קנה מידה כלשהו.
   1. הכנה בינונית צמיחה : במדיית הרחבת תאים המטופיאטיים ללא סרום (שחוממה בעבר ל-37 °C) מוסיפים פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG) 1x, ליפופרוטאין אנושי בצפיפות נמוכה (hLDL) ב-20 מיקרוגרם/מ"ל, קוקטייל ציטוקינים של הרחבת מגה-קריוציט 1x ו-Stemregenin 1 (SR1) ב-1 מיקרומטר.
   2. זריעת תאים : צנטריפוגה CD34 + הפשרה תאים ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הסר ביסודיות את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיה תרבית ולבצע ספירת תאים ושמיה כדי לקבוע את הנפח המתאים כדי לזרוע את התאים.
   3. צנטריפוגות התאים 400 x g בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות resuspend הכדור בנפח המתאים של מדיום הצמיחה החמה. לדגור על התאים ב 37 °C (5% CO₂₎ במשך 7 ימים.
3. פרוטוקול תרבות, שלב 2: מהיום השביעי ועד היום ה-13(איור 3B, תמונות מייצגות ביום 13)
   הערה: בדרך כלל תרביות נעשות לוחות 24-well עם 1 מ"ל בינוני לבאר בצפיפות של 50,000 תאים קיימא / מ"ל, המקביל 25,000 תאים קיימא / cm². חשוב לכבד צפיפות זו אם מתוכנן שינוי קנה מידה כלשהו.
   1. הכנה בינונית להבשלה: במדיית הרחבת תאים המטופויאטיים ללא סרום (שחוממה בעבר ל-37 °C) הוסיפו PSG 1x, hLDL ב-20 מיקרוגרם/מ"ל, TPO ב-50 ננוגרם/מ"ל ו-SR1 ב-1 מיקרומטר.
   2. בחן את התאים מתחת למיקרוסקופ. ביום 7, תאים מציגים מראה עגול והומוגני על ידי מילוי בארות או הבקבוקונים מבלי להיות יותר מדי.
   3. תחת ארון בטיחות ביולוגית, בעדינות להעביר את התאים בצינור 15 מ"ל. לשטוף בארות עם PBS. לאחר מכן, לקבוע את מספר התאים ואת הכדאיות שלהם כדי לחשב את אמצעי האחסון המתאים לזרוע את התאים.
   4. צנטריפוגות התאים ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים בנפח המתאים של מדיה חמה מחושב בשלב הקודם. לדגור על התאים ב 37 °C (5 °F), 5% CO₂ במשך 6 ימים.
4. שחרור טסיות דם תרבותיות ביום 13
   1. הוסף 0.5 μM של פרוסטגלנדין I₂ (PGI₂₎ ו 0.02 U / mL של apyrase לתרבות ולבצע צנרת רצופה חמש פעמים עם פיפטה 1 מ"ל.
      הערה: טסיות דם משתחררות כעת למדיום.

3. ניתוח ציטומטריית זרימה (MK פנוטיפינג וטסיות דם תרבותיות לספור)

הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על phenotyping של התאים בימי התרבות שנבחרו. זה גם מאפשר את קביעת מספר שחרור טסיות הדם התרבותי(איור 4A,B).

1. הכנה לניתוח ח"כים
   1. תייג ארבעה סטים של צינורות microcentrifuge כדלקמן: תאים ללא תווית כמו שליטה, תאים + 5 μL CD41 - אלכסה פלור 488, תאים + 5 μL CD34 - PECy7, תאים + 5 μL CD41 - אלכסה פלור 488 + 5 μL CD34 - PECy7. השתמש מינימום של 1.10⁵ תאים לכל צינור, לא יעלה על 1.10⁶ תאים לכל צינור. הוסף 100 μL של השעיית התא לכל צינור ציטומטריה ואת הנוגדנים השונים. דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 °C (50 °F).
   2. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של PBS-EDTA 2 מ"מ לכל צינור וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון של PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100), לאפשר פתרון 300 μL לכל צינור.
   3. הסר את supernatant ולקחת את הכדור ב 300 μL של PBS-EDTA 2 mM עם 7AAD. הפעל דגימות דרך cytometer הזרימה בתוך 30 דקות.
      הערה: אסטרטגיית ניתוח לציטומטריית זרימה מוצגת באיור 3C ובדיון.
2. הכנת צינור לניתוח טסיות דם תרבותיות
   1. תווית ארבעה סטים של צינורות microcentrifuge כדלקמן: תאים ללא תווית כמו שליטה, תאים + 5 μL CD41 - אלכסה פלור 488, תאים + 20 μL CD42a - PE, תאים + 5 μL CD41 - אלכסה פלור 488 + 20 μL CD42a - PE. לאחר חמישה צינורות רצופים בתרבות היטב, להעביר 300 μL של ההשעיה בצינור עבור cytometry המכיל מספר מכויל של חרוזים פלואורסצנטיים.
   2. מוסיפים נוגדנים ודגרה בחושך ב RT במשך 30 דקות.
   3. הפעל את הדגימות דרך cytometer הזרימה בתוך 30 דקות וקבע את הרכישה למעבר של 5,000 חרוזים.
      הערה: אסטרטגיית ניתוח לציטומטריית זרימה מוצגת באיור 4B ובדיון.

תוצאות

מיצוי ובחירה של תאי CD34+ ממפות LRF
כאן, השיטה, נגזרת Peytour ואח^'9, מתאר את החילוץ והבחירה של CD34⁺ תאים מ LRFs זרוק זמין בבנקי דם לאחר הסרת לויקוציטים. בעקבות הליך הזרימה האחורית, בדרך כלל 1.03 x 10⁹ ± 2.45 x 10⁸ תאים / LRF (ממוצע±SEM; n = 155) הם התאוששו עם הכדאיות של 94.88 ± 0.10% (

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור MK המסוגלת לפלוט פרופלטלטים מ- HP שמקורה בדם ולשחרר טסיות דם מדיום התרבות. HP מתקבלת מ- LRF, תוצר לוואי של בנקי הדם, המשמשת להסרת לויקוציטים מזהמים ממוצרי דם תאיים ולהימנע מתופעות לוואי. למרות ששיטה זו היא פשוטה יחסית, כמה נקודות ראויות לתשומת לב מיוחדת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material