Filtri leucodeplezione-Cellule CD34+ derivate come fonte cellulare per studiare la differenziazione dei megacariociti e la formazione piastrinica

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie per ottenere i progenitori ematopoietici CD34+ derivati dal leucofiltro e la loro differenziazione e maturazione in vitro in megacariociti portatori di proplatelet che sono in grado di rilasciare piastrine nel terreno di coltura. Questa procedura è utile per l'analisi approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari che controllano la megacariopoiesi.

Abstract

L'espansione e la differenziazione in vitro di progenitori ematopoietici umani in megacariociti in grado di allungare i proplatatori e rilasciare piastrine consente uno studio approfondito dei meccanismi alla base della biogenesi piastrinica. I protocolli di coltura disponibili si basano principalmente su progenitori ematopoietici derivati dal midollo osseo o dal sangue del cordone ombelicale che sollevano una serie di preoccupazioni etiche, tecniche ed economiche. Se ci sono già protocolli disponibili per ottenere cellule CD34 dal sangue periferico, questo manoscritto propone un protocollo semplice e ottimizzato per ottenere cellule CD34 + da filtri leucodeplezione prontamente disponibili nei centri del sangue. Queste cellule sono isolate dai filtri leucodepletici utilizzati nella preparazione di prodotti trasfusionali, corrispondenti a otto donazioni di sangue. Questi filtri sono pensati per essere scartati. Viene descritta una procedura dettagliata per raccogliere progenitori ematopoietici identificati come cellule CD34+ da questi filtri. Il metodo per ottenere megacariociti maturi che estendono i proplati mentre discutono della loro evoluzione fenotipica è anche dettagliato. Infine, il protocollo presenta un metodo di pipettaggio calibrato, per rilasciare in modo efficiente piastrine morfologicamente e funzionalmente simili a quelle native. Questo protocollo può servire come base per valutare i composti farmacologici che agiscono in varie fasi del processo per sezionare i meccanismi sottostanti e avvicinarsi alle rese piastriniche in vivo.

Introduzione

Le piastrine del sangue provengono da grandi cellule poliploidi specializzate, i megacariociti (MK), che provengono da un processo di produzione costante e messo a punto noto come megacariopoiesi (MKP). All'apice di questo processo ci sono le cellule staminali ematopoietiche che, a contatto con l'ambiente del midollo osseo (citochine, fattori di trascrizione, nicchia ematopoietica), saranno in grado di proliferare e differenziarsi in progenitori ematopoietici (HP) in grado di impegnarsi verso la via megacariocitica, dando origine a NK immaturi^1. Sotto l'influenza di varie citochine, e in particolare della trombopoietina (TPO), che è la principale citochina di MKP; l'MK subirà quindi due principali fasi di maturazione: l'endomitosi e lo sviluppo delle membrane di demarcazione (DMS). Questo MK completamente maturo appare quindi vicino a un vaso sinusoide in cui può emettere estensioni citoplasmatiche, le proplatelet, che verranno rilasciate sotto il flusso sanguigno e successivamente rimodellate in piastrine funzionali². La clonazione di TPO nel 1994³ ha fornito una spinta nello studio di MKP accelerando lo sviluppo di tecniche di coltura in vitro che consentono la differenziazione HP e la maturazione MK.

Ci sono molte patologie che colpiscono le piastrine del sangue, sia in termini di numero di piastrine (aumento o diminuzione) che di funzione^4,5. Essere in grado di ricapitolare MKP in vitro da HP umano potrebbe migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questo processo e, in definitiva, la gestione terapeutica dei pazienti.

Sono adatte varie fonti di HP umano: sangue cordonale, midollo osseo e sangue periferico^6,7,8. La raccolta di HP dal sangue periferico solleva meno problemi logistici ed etici rispetto al loro recupero dal sangue del cordone ombelicale o dal midollo osseo. L'HP può essere recuperato dalla leucoaferesi o dal buffy coat, ma queste fonti sono costose e non sempre disponibili nei centri del sangue. Altri protocolli, meno costosi e più facili da eseguire, consentono il recupero diretto delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) senza la necessità di un precedente isolamento guidato da CD34^4,8. Tuttavia, la purezza dei megacariociti non è soddisfacente con questo metodo e una selezione di cellule CD34 + da PBMC è raccomandata per una differenziazione ottimale in MK. Questo ci ha portato a implementare una purificazione HP da filtri a leucoriduzione (LRF), abitualmente utilizzati nelle banche del sangue per rimuovere i globuli bianchi ed evitare così reazioni immunologiche avverse⁹. Infatti, dal 1998, i concentrati piastrinici sono stati automaticamente leucodepliati in Francia. Alla fine di questo processo, gli LRF vengono scartati e tutte le cellule trattenute nell'LRF vengono distrutte. Le celle nei LRF sono, quindi, prontamente disponibili senza costi aggiuntivi. Gli LRF hanno un contenuto cellulare vicino a quello ottenuto dalla leucaferesi o in buffy coats, in particolare nella loro composizione di CD34+ HP che li rende una fonte notevolmente attraente¹⁰. LRF come fonte umana di HP ha già dimostrato di fornire alle cellule capacità funzionali intatte¹¹. Questa fonte ha il vantaggio di essere abbondante e conveniente per la ricerca di laboratorio. In questo contesto, questo articolo descrive successivamente: i) l'estrazione e la selezione di CD34⁺ HP da LRF; ii) una coltura ottimizzata in due fasi, che ricapitola l'impegno di HP nella via megacariocitica e la maturazione di MK in grado di emettere proplatelet; iii) un metodo per rilasciare in modo efficiente piastrine da questi MK; e iv) una procedura per la fenotipizzazione di MK e piastrine coltivate.

Protocollo

I campioni umani di controllo sono stati ottenuti da donatori di sangue volontari che hanno dato il consenso informato scritto reclutato dal centro trasfusionale in cui è stata eseguita la ricerca (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Tutte le procedure sono state registrate e approvate dal Ministero francese dell'istruzione superiore e della ricerca e registrate con il numero AC_2015_2371.I donatori hanno dato la loro approvazione nel modulo di consenso CODHECO ac- 2008 - 562, affinché i campioni vengano utilizzati a fini di ricerca. Gli studi sull'uomo sono stati condotti secondo la dichiarazione di Helsinki.

1. Estrazione e selezione di celle CD34+ (HP) da LRF

1. Preparazione del reagente (per un LRF)
   1. Preparare 25 mL di tampone di eluizione filtrato: 21,25 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS), 2,5 mL di Acido-Citrato-Destrosio (ACD) e 1,25 mL di Siero Bovino Fetale Decomplementato (FBS). Filtrare su 0,22 μm e posizionare a 37 °C.
   2. Preparare 500 mL di PBS con 2 mM di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA).
   3. Smaltire 25 mL di gradiente di densità medio (DGM) (1.077 g/mL) in due tubi da 50 mL.
2. Modalità di risciacquo LRF (Figura 1)
   NOTA: questo passaggio richiede una saldatrice per tubi sterile, che consenta il collegamento sterile di tubi termoplastici.
   1. Innanzitutto, collegare l'LRF a un sacchetto di trasferimento vuoto da 600 ml e l'LRF a un set di tubi (Figura 1A). Sotto l'armadio di biosicurezza, iniettare il volume totale del tampone di eluizione filtrato e preparato corrispondente al numero di LRF movimentati (xLRF x 25 mL) nel sacchetto vuoto. Quindi, utilizzando una siringa da 30 mL per aspirare delicatamente l'intero contenuto del sacchetto attraverso l'LRF, eseguire il backflush e trasferire le cellule in un nuovo tubo da 50 mL (Figura 1B).
   2. Alla sedimentazione dei globuli rossi, diluire la sospensione cellulare della metà con Destrone 2% e mescolare bene per aggregare i globuli rossi. Attendere 30 minuti a temperatura ambiente (RT).

Figura 1: Modalità di risciacquo della LRF. (A) Schema rappresentativo di (i) il collegamento sterile del sacchetto di trasferimento al LRF e (ii) il set di tubi al LRF. (B) Schema rappresentativo del collegamento delle siringhe per la raccolta delle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Collezione PBMC
   1. Dopo la sedimentazione dei globuli rossi, rimuovere e trasferire il surnatante in un tubo da 50 ml e riempirlo con PBS-EDTA 2 mM. Sovrapporre delicatamente il surnatante sul DGM sopra preparato. Lasciate che il surnatante scorra delicatamente senza rompere il piano superficiale del gradiente di densità. Centrifuga a 400 x g a RT per 30 minuti in modalità brake off.
   2. Raccogliere lo strato PBMC con una pipetta di trasferimento usa e getta. Trasferire le cellule da ciascun tubo DGM in un nuovo tubo sterile da 50 ml. Riempire ogni tubo con PBS-EDTA 2 mM e lavare due volte in 50 mL di PBS-EDTA 2 mM a 200 x g per 10 minuti a RT in modalità brake on.
   3. Pipettare e mettere in comune il pellet della cella con 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
      NOTA: C'è la possibilità di interrompere la procedura mantenendo le cellule raccolte sotto agitazione a 4 °C durante la notte. Quindi, filtrare la sospensione con un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere gli aggregati formati.
4. Selezione delle celle CD34+
   1. Determinare il numero di cellule e centrifugare a 400 x g a temperatura ambiente per 10 minuti con la rottura attivata.
   2. Aspirare completamente il surnatante e riaspensionare nel volume appropriato di PBS-EDTA 2 mM dettagliato dal produttore del kit di selezione CD34 (300 μL di PBS-EDTA per 10⁸ celle). Aggiungere il reagente bloccante FcR e le microsfere CD34 nella concentrazione appropriata (50 μL per 10⁸ cellule).
   3. Dopo 30 minuti a 4 °C, lavare la sospensione cellulare e risospenare nel volume appropriato di PBS-EDTA 2 mM dettagliato dal produttore del kit di selezione CD34 (500 μL per 10⁸ celle).
      NOTA: La selezione viene effettuata su colonne di ordinamento per il passaggio di massimo 2 x 10⁹ celle per colonna.
   4. Passare il campione sulla colonna bagnata del magnete. Lavare due volte con 3 mL di PBS-EDTA 2 mM ed eluire le cellule con 5 mL di PBS-EDTA 2 mM. Una seconda esecuzione su una nuova colonna seguendo la stessa procedura è necessaria per migliorare la purezza del campione.
      NOTA: un numero previsto di 6,1 x 10⁵ celle/LRF (Figura 2A). Per numeri LRF più elevati, aumentare di conseguenza i reagenti e i metodi.
5. Valutazione della purezza cellulare CD34+
   1. Aggiungere ad un'aliquota di 100 μL di sospensione ottenuta dopo la selezione^CD34+, 2 μL di anticorpo umano CD34-PE o 2 μL di IgG - PE (controllo). Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
   2. Lavare le celle aggiungendo 2 ml di PBS e centrifugare a 400 x g per 5 min. Aspirare completamente il surnatante e spese in 200 μL di PBS.
   3. Analizzare la purezza mediante citometria a flusso come mostrato nella Figura 2A e nella Discussione.
      NOTA: si prevede una purezza delle celle CD34+ superiore al 90% (Figura 2Bii).
   4. Utilizzare le celle CD34+ direttamente o congelare per un ulteriore utilizzo.
6. Congelamento delle cellule CD34+
   NOTA: il congelamento delle cellule CD34+ viene eseguito a una densità di^{10 6} celle per ml.
   1. Dopo la determinazione del numero di cellule CD34+, preparare i seguenti mezzi di crioconservazione: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) e consentire il raffreddamento a 4 °C.
   2. Centrifugare le celle CD34+ a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min e risusciere il pellet in soluzione fredda 1 e poi aggiungere immediatamente alla soluzione fredda 2 (v/v).
   3. Posizionare immediatamente i criotubi in un congelatore a -80 °C per 24 ore e quindi trasferire i criotubi nel serbatoio dell'azoto liquido.

2. Coltura e differenziamento di cellule CD34+ per produrre megacariociti maturi portatori di proplatelet

NOTA: Protocollo di coltura cellulare (Figura 3A), schema rappresentativo della procedura di coltura cellulare sono dettagliati in questa sezione.

1. Scongelamento delle celle CD34+ (se necessario)
   1. Preparare la soluzione di scongelamento: 13 ml di PBS-20% FBS e posizionare a 37 °C per 15 min. Trasferire rapidamente i criotubi a bagnomaria a 37 °C fino a un solo piccolo cristallo di ghiaccio. Sotto l'armadio della coltura biologica, pipettare l'intero contenuto e trasferire lentamente in 13 ml di soluzione di scongelamento prebellica.
   2. Determinare il numero di cellule e la vitalità delle cellule.
2. Protocollo di coltura, fase 1: dal giorno 0 al giorno 7
   NOTA: Di solito le colture sono fatte in piastre a 24 pozzetti con 1 mL di mezzo per pozzetti ad una densità di 40.000 cellule vitali / mL, corrispondenti a 20.000 cellule vitali / cm². È fondamentale rispettare questa densità se è previsto uno scale-up.
   1. Preparazione del mezzo di crescita : Nei mezzi di espansione delle cellule ematopoietiche privi di siero (precedentemente riscaldati a 37 °C) aggiungere Penicillina-Streptomicina-Glutammina (PSG) 1x, Lipoproteina umana a bassa densità (hLDL) a 20 μg/mL, cocktail di citochine di espansione dei megacariociti 1x e Stemregenina 1 (SR1) a 1 μM.
   2. Semina cellulare : Centrifugare le cellule CD34+ scongelate a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere accuratamente il surnatante e risusegare il pellet cellulare in 1 mL di substrato di coltura ed eseguire una numerazione cellulare e la vitalità per determinare il volume appropriato per seminare le cellule.
   3. Centrifugare le celle 400 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e risusciere il pellet nel volume appropriato del terreno di crescita caldo. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per 7 giorni.
3. Protocollo di coltura, fase 2: dal giorno 7 al giorno 13(Figura 3B,immagini rappresentative al giorno 13)
   NOTA: Di solito le colture sono fatte in piastre a 24 pozzetti con 1 mL di mezzo per pozzetti ad una densità di 50.000 cellule vitali / mL, corrispondenti a 25.000 cellule vitali / cm². È fondamentale rispettare questa densità se è previsto uno scale-up.
   1. Preparazione del mezzo di maturazione: nei mezzi di espansione delle cellule ematopoietiche privi di siero (precedentemente riscaldati a 37 °C) aggiungere PSG 1x, hLDL a 20 μg/mL, TPO a 50 ng/mL e SR1 a 1 μM.
   2. Esaminare le cellule al microscopio. Al giorno 7, le cellule mostrano un aspetto rotondo e omogeneo riempiendo i pozzezze o i palloni senza essere troppo confluenti.
   3. Sotto un armadio di biosicurezza, trasferire delicatamente le cellule in un tubo da 15 ml. Lavare i pozzi con PBS. Quindi, determinare il numero di cellule e la loro vitalità per calcolare il volume appropriato per seminare le cellule.
   4. Centrifugare le celle a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospentare le cellule nel volume appropriato di mezzo caldo calcolato nel passaggio precedente. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 6 giorni.
4. Rilascio piastrinico coltivato al giorno 13
   1. Aggiungere 0,5 μM di prostaglandina I₂ (IGP₂₎ e 0,02 U/mL di apirasi alla coltura ed eseguire il pipettaggio successivo cinque volte con una pipetta da 1 mL.
      NOTA: le piastrine vengono ora rilasciate nel mezzo.

3. Analisi della citometria a flusso (fenotipizzazione MK e conta piastrinica in coltura)

NOTA: Questo protocollo può essere applicato alla fenotipizzazione delle cellule nei giorni di coltura selezionati. Permette inoltre la determinazione del numero del rilascio piastrinico coltivato (Figura 4A,B).

1. Preparazione per l'analisi MK
   1. Etichettare quattro set di tubi microcentrifuga come segue: Celle non etichettate come controllo, celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celle + 5 μL CD34 - PECy7, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Utilizzare un minimo di 1,10⁵ celle per tubo, non superare 1,10⁶ celle per tubo. Aggiungere a 100 μL di sospensione cellulare per tubo citometrico e i diversi anticorpi. Incubare al buio per 30 minuti a 4 °C.
   2. Quindi, aggiungere 2 ml di PBS-EDTA 2 mM per tubo e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Durante la centrifugazione, preparare una soluzione di PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomicina-D (7AAD) (1/100), consentire una soluzione di 300 μL per tubo.
   3. Rimuovere il surnatante e prendere il pellet in 300 μL di PBS-EDTA 2 mM con 7AAD. Eseguire i campioni attraverso il citometro a flusso entro 30 minuti.
      NOTA: La strategia di analisi per la citometria a flusso è mostrata nella Figura 3C e nella Discussione.
2. Preparazione del tubo per l'analisi piastrinica in coltura
   1. Etichettare quattro set di tubi microcentrifuga come segue: Celle non etichettate come controllo, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celle + 20 μL CD42a - PE, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Dopo cinque pipettaggio successivi in pozzo di coltura, trasferire 300 μL della sospensione in tubo per citometria contenente un numero calibrato di perle fluorescenti.
   2. Aggiungere anticorpi e incubare al buio a RT per 30 minuti.
   3. Eseguire i campioni attraverso il citometro a flusso entro 30 minuti e impostare l'acquisizione per il passaggio di 5.000 perle.
      NOTA: La strategia di analisi per la citometria a flusso è mostrata nella Figura 4B e nella Discussione.

Risultati

Estrazione e selezione di celle CD34+ da LRF
Qui, il metodo, derivato da Peytour et al.⁹, descrive l'estrazione e la selezione di cellule CD34⁺ da LRF scartati disponibili nelle banche del sangue dopo la rimozione dei leucociti. Seguendo la procedura di backflush, di solito 1,03 x^{10 9} ± 2,45 x 10⁸ celle / LRF (Mean±SEM; n = 155) vengono recuperati con una vitalità del 94,88 ± 0,10% (Figura 2A i)...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di MK in grado di emettere proplatelet da HP derivati dal sangue e di rilasciare piastrine dal terreno di coltura. Gli HP sono ottenuti da LRF, un sottoprodotto delle banche del sangue, utilizzato per rimuovere i leucociti contaminanti dagli emoderivati cellulari ed evitare reazioni avverse. Sebbene questo metodo sia relativamente semplice, alcuni punti meritano un'attenzione speciale.

La deposizione della sospensione cellulare sul mezzo d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human	Miltenyi biotec	130-100-453
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.OR	Or equivalent material
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Or equivalent material
Cryotubes	Dutscher	55002	Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Or equivalent material
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Flow Cytometer	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
Inserts	Fenwal	R4R1401	Or equivalent material
Laminar flow hood	Holten	NA	Archived product
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Or equivalent material
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Macopharma	VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan Expansion Supplement (100x)	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
Syringues 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
Tubes 50 mL	Sarstedt	62.548.004 PP	Or equivalent material
Tubes 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Or equivalent material
Tubulures	B Braun	4055137	Or equivalent material